检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113151514A(43)申请公布日2021.07.23(21)申请号202110313278.4(22)申请日2021.03.24(71)申请人黄婉秋地址201210上海市浦东新区创新西路300弄23号1401室申请人黄健(72)发明人黄婉秋黄健(74)专利代理机构上海序伦律师事务所31276代理人周东萍(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6848(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图3页(54)发明名称检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对和探针。本发明的检测结核分支杆菌的试剂盒，基于巢式RPA检测技术(nestRPA)，最低可检出1拷贝/uL的结核分支杆菌核酸片段，具有超高灵敏度，且无需昂贵检测设备，检测时间短，最短仅需15分钟，该技术有利于早期发现感染结核分支杆菌人群，为感染结核分支杆菌人群的早期隔离和早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。CN113151514ACN113151514A权利要求书1/1页1.一种检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对是针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对。2.根据权利要求1所述的检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对是以巢式RPA检测结核分支杆菌的引物对，其包含外引物对和内引物对。3.根据权利要求2所述的检测结核分支杆菌的引物对，其特征在于，所述外引物对具有如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的碱基序列，所述内引物对具有如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的碱基序列。4.一种检测结核分支杆菌的探针，其特征在于，所述探针是特异性针对SEQIDNO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的探针。5.根据权利要求4所述的检测结核分支杆菌的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQIDNO：2所示的碱基序列。6.一种检测结核分支杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1‑3中任一项所述的引物对。7.根据权利要求6所述的检测结核分支杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含权利要求4或5所述的探针。8.一种以巢式RPA检测结核分支杆菌的方法，包括以下步骤：用针对结核分支杆菌IS6110基因的一对外引物，以待测样本核酸为模板进行第一次RPA反应，扩增目的基因第一片段；用针对结核分支杆菌IS6110基因的一对内引物，以扩增出的目的基因第一片段为模板、并在加入结核分支杆菌IS6110基因特异性信号探针的条件下进行第二次RPA反应，扩增目的基因第二片段；通过检测探针信号，获得结核分支杆菌核酸的检测结果。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述信号探针为荧光素标记的探针，所述检测探针信号是利用荧光检测设备检测标记在探针上的荧光素信号。10.权利要求6或7所述试剂盒在制备检测结核分支杆菌的产品中的应用。2CN113151514A说明书1/9页检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于巢式RPA(nestRPA)技术检测结核分支杆菌IS6110基因的引物对、探针、试剂盒及其应用。背景技术[0002]结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。排菌者为其重要的传染源。人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病。若能及时诊断，并给予合理治疗，大多可获临床痊愈。[0003]结核菌属于放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，为有致病力的耐酸菌。主要分为人、牛、鸟、鼠等型。对人有致病性的主要是人型菌，牛型菌少有感染。1882年，德国细菌学家郭霍(RobertKoch，1843‑1910)首先发现并证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。[0004]结核病临床特征为：有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热(午后为著)、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。结核分枝杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。[0005]结核病严重影响人类健康和生命，人类与之斗争了许多世纪。在17‑18世纪的欧洲，结核病被称为"白色瘟疫"，几乎100％的欧洲人被感染，25％的欧洲人死亡。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾