羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107937574A(43)申请公布日2018.04.20(21)申请号201711131064.5(22)申请日2017.11.15(71)申请人锦州医科大学地址121000辽宁省锦州市松坡路三段40号申请人辽宁省畜牧科学研究院(72)发明人李冰朱延旭宋先忱张兴会刘孝刚刘宇明季伟(74)专利代理机构锦州辽西专利事务所(普通合伙)21225代理人王佳佳(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页附图4页(54)发明名称羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法(57)摘要一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法，检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF。试剂盒包括Tris·HCl，KCl，(NH4)2SO4，Tween20，甜菜碱，MgSO4，dNTPeach，BstDNApolymerase，钙黄绿素指示剂，LAMP检测引物。利用LAMP试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，绿色表示检测为阳性，橙色表示检测为阴性。优点是：具有简便、快速、准确、廉价、可视等优点，可用于畜牧业生产单位筛查和检测羊副结核分支杆菌，对羊副结核病的净化与控制具有重要意义。CN107937574ACN107937574A权利要求书1/1页1.一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF，其特征是：各引物序列具体如下：F3：5′-CCTAGACTCGCGGACTCTT-3′；B3：5′-CACGGGTCACGTAGAAACG-3′；FIP：5′-CGGGCATCGAAGATCGCTACCAATTGTGACGTACGGGCTAC-3′；BIP：5′-TGGTCGATATCGGAGCTCCTCTGTTCCATCGACAGCTCAGC-3′；LF：5′-CGAATGCGTTCTGCCCCA-3′。2.如权利要求1所述的LAMP检测引物在羊副结核分支杆菌的中的应用。3.一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：包含23μL检测溶液，所述的检测溶液包括：20mMTris·HCl、pH为8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNApolymerase，钙黄绿素指示剂1μL，引物加入量为：5pmol正向外引物F3和5pmol反向外引物B3，40pmol正向内引物FIP和40pmol反向内引物BIP，5pmol正向环引物LF，最后用ddH2O补足至23μL；其中各引物具体序列如下：F3：5′-CCTAGACTCGCGGACTCTT-3′；B3：5′-CACGGGTCACGTAGAAACG-3′；FIP：5′-CGGGCATCGAAGATCGCTACCAATTGTGACGTACGGGCTAC-3′；BIP：5′-TGGTCGATATCGGAGCTCCTCTGTTCCATCGACAGCTCAGC-3′；LF：5′-CGAATGCGTTCTGCCCCA-3′。4.根据权利要求3所述的羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：所述钙黄绿素指示剂1μL包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。5.如权利要求3所述的LAMP检测试剂盒在羊副结核分支杆菌的中的应用。6.根据权利要求5所述的羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒在羊副结核分支杆菌的中的应用，其特征是：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，绿色表示检测为阳性，存在羊副结核分支杆菌，橙色表示检测为阴性，不存在羊副结核分支杆菌。7.根据权利要求5所述的羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒在羊副结核分支杆菌的中的应用，其特征在于：提取待检微生物的DNA，取2μLDNA溶液，加入23μLLAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：60℃～65℃，45min～55min，扩增产物进行颜色变化的观察。8.根据权利要求7所述的羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒在羊副结核分支杆菌的中的应用，其特征在于：LAMP扩增条件为：63℃恒温50min。2CN107937574A说明书1/7页羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域