疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109897911A(43)申请公布日2019.06.18(21)申请号201910236404.3(22)申请日2019.03.26(71)申请人南京林业大学地址210037江苏省南京市玄武区龙蟠路159号(72)发明人张晨熊琴钱雨琳郑新月李雪(74)专利代理机构南京申云知识产权代理事务所(普通合伙)32274代理人邱兴天(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图1页(54)发明名称疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明公开了一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用。该LAMP检测引物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；检测试剂盒包括LAMP检测引物、LAMP反应液。本发明根据疫霉菌P.hydropathica的翻译延伸因子EF-TU序列设计引物，采用LAMP技术进行检测，特异性强、灵敏度高，具有快速、准确性高、现场应用方便等优点，解决了现有疫霉菌P.hydropathica检测技术中存在的周期长、灵敏度低、成本高、现场应用困难等缺陷，对疫霉菌P.hydropathica检疫鉴定、监测和减少对农药盲目使用方面具有重要意义。CN109897911ACN109897911A权利要求书1/1页1.一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成，各引物序列具体如下：FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。2.权利要求1所述的LAMP检测引物在检测疫霉菌P.hydropathica中的应用。3.一种疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒，其特征在于：至少包括1次用量以上的引物溶液和LAMP反应液；其中，引物溶液中的引物为正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB，各引物序列具体如下：FIP：5′-TGCTTCACGCCGAGCGTGAACTCCAAGGAGGGCCAGAC-3′；BIP：5′-TGGACGACTCCTCGGTCATGTCCTTCTTCAGGTACGTGGTC-3′；F3：5′-GGGCGAGTTCGAGGCT-3′；B3：5′-CTTGGCCGGCTTGTAGC-3′；LB：5′-TCGTTACGACGAGATCAAGAACGAG-3′。4.权利要求3所述的疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的LAMP反应液含有10×ThermoPolBuffer、MgSO4、甜菜碱、dNTPs、Bst聚合酶和显色剂HNB。5.权利要求3所述的疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测试剂盒在检测疫霉菌P.hydropathica中的应用。6.一种检测疫霉菌P.hydropathica的方法，其特征在于：提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的LAMP检测引物或权利要求3所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在疫霉菌P.hydropathica；紫色表示检测结果为阴性，不存在疫霉菌P.hydropathica。2CN109897911A说明书1/7页疫霉菌P.hydropathica的LAMP检测引物、检测试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种疫霉菌Phytophthorahydropathica的环介导等温扩增(LAMP)检测引物、检测试剂盒及其应用，可用于疫霉菌P.hydropathica的快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于疫霉菌P.hydropathica的早期诊断和病菌的检测和鉴定。背景技术[0002]疫霉菌Phytophthorahydropathica属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiac