马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102424865A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102424865A(43)申请公布日2012.04.25(21)申请号201110426985.0C12N15/11(2006.01)(22)申请日2011.12.19C12R1/93(2006.01)(71)申请人山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址266002山东省青岛市市南区瞿塘峡路70号(72)发明人郑小龙徐彪梁成珠王群朱来华邓明俊岳志芹肖西志赵玉然(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人张中南(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页(54)发明名称马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法(57)摘要本发明涉及一种马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。CN1024865ACCNN110242486502424872A权利要求书1/1页1.一种马动脉炎病毒的液相芯片检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针的核酸序列如下：正向引物：SEQIDNO：1反向引物：`SEQIDNO：2探针：`SEQIDNO：3。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于所述的正向引物和反向引物5’端进行生物素标记；探针的5’端进行氨基化修饰。3.一种液相芯片检测马动脉炎病毒的方法，其特征在于，是用权利要求2所述的引物和探针进行检测。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括有：1)检测样品RNA的提取、2)RT-PCR扩增目的片段、3)寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR扩增片段杂交和5)液相芯片仪分析步骤。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤2)RT-PCR反应的循环条件为：第一阶段，反转录50℃：30min；第二阶段，预变性94℃：3min；第三阶段，扩增94℃：30s，59℃：30s，72℃：30s，30个循环；第四阶段，延伸72℃：5min。2CCNN110242486502424872A说明书1/5页马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法技术领域[0001]本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及一种马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。背景技术[0002]马病毒性动脉炎(EquineViralAteritis，EVA)是一种由马病动脉炎病毒(EquineAteritisVirus，EAV)引起，在马属动物之间通过呼吸道或生殖器官传播的传染病。马匹感染EAV后大部分呈亚临床感染，一部分成年马的流感样症状、怀孕母马发生流产，新生马驹发生间质性肺炎。约有30％-60％种公马感染EAV后持续带毒，精液中的病毒可传播给雌马，引起EAV的传播。该病在临疹上表现为发热、白细胞减少，常伴有眼睑水肿和四肢浮肿，其特征性病理变化为小动脉内膜变性和坏死。[0003]本病主要以美洲和欧洲为中心呈世界性分布，以小规模或中等规模的流行形式反复发生。澳大利亚虽然没有临床症状发生，但是通过对保存血清的检查表明，1975年澳大利亚就有EAV抗体阳性马。对1989-1992年收集的马血清检查结果表明，南非也有抗体阳性马。1996年日本发现EAV抗体阳性的赛马。1996年我国出口韩国的马匹中也发现了EAV抗体阳性马，但至今没有从马匹中分离到EAV。[0004]近年来，由于赛马业的发展和国外对食用马的需求，进出口马病的检测量不断增加。国内外研究者开发了多项马病快速检测诊断方法，如山东检验检疫局马病实验室研究的ELISA、PCR检测马鼻肺炎和马动脉炎，固相基因芯片技术检测五种马病等这些方法基本上实现了快速检测的需要。但是有些病还没有成熟的检测技术及试剂，如锥虫病、焦虫病等还需要用进口检测试剂。进口试剂和试剂盒特别昂贵，且使用时必须提前2个月左右定货，会严重影响检测进程。此外，现有的快速检测方法中，ELISA、PCR等技术通量小，费时费力；固相芯片技术可以实现高通量检测，但成本特别昂贵，无法在马病检测中应用。迫切需要一种高通量、低成本、快速特异、灵敏可靠检测方法。发明内容[0005]本发明的目的是提供马动脉炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，即一种操作简单、结果准确的马动脉炎病毒液相芯片检测方法，及其所用到的引物，从而弥补现有技术的不足。[0006]本