马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102433394A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102433394A(43)申请公布日2012.05.02(21)申请号201110426427.4C12N15/11(2006.01)(22)申请日2011.12.19G01N21/64(2006.01)(71)申请人山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址266002山东省青岛市市南区瞿塘峡路70号(72)发明人郑小龙徐彪梁成珠朱来华王群肖西志岳志芹邓明俊孙涛赵玉然(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人张中南(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页(54)发明名称马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法(57)摘要本发明涉及一种马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法，本发明的检测方法能够对样品进行快速检测，从样品处理到出结果仅需4小时左右；由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法可与荧光定量PCR相媲美。本发明设计的引物与常见马属动物其他病毒不发生交叉反应，由于采用了液相反应体系，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。本发明的方法提供了优化的操作程序，操作简单，具有良好重复性。CN102439ACCNN110243339402433398A权利要求书1/1页1.一种马鼻肺炎病毒的液相芯片检测的引物和探针，其特征在于，引物和探针的核酸序列如下：正向引物：SEQIDNO：1反向引物：`SEQIDNO：2探针：`SEQIDNO：3。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于所述的正向引物和反向引物5′端进行生物素标记；探针的5′端进行氨基化修饰。3.一种液相芯片检测马鼻肺炎病毒的方法，其特征在于，是用权利要求2所述的引物和探针进行检测。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括有：1)检测样品RNA的提取、2)RT-PCR扩增目的片段、3)寡核苷酸探针与微球共价偶联、4)探针与RT-PCR扩增片段杂交和5)液相芯片仪分析步骤。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的步骤2)RT-PCR反应的循环条件为：第一阶段，反转录50℃：30min；第二阶段，预变性94℃：3min；第三阶段，扩增94℃：30s，59℃：30s，72℃：30s，30个循环；第四阶段，延伸72℃：5min。2CCNN110243339402433398A说明书1/5页马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法技术领域[0001]本发明属于动物病毒检测技术领域，具体涉及一种马鼻肺炎病毒的液相芯片检测引物及检测方法。背景技术[0002]马鼻肺炎(Equinerhinopneumonitis，ER)是马属动物几种高度接触传染性疾病的总称，其病原体为亲缘关系密切的两种疱疹病毒：马疱疹病毒1型(EHV-1)和马疱疹病毒4型(EHV-4)。马鼻肺炎是马的一种急性发热性传染病。在敏感马群中可100％感染，1993年6月在新疆野马繁殖中心野马群中爆发的马鼻肺炎流行过程中，马群100％感染，成年马临床症状较轻而幼驹症状严重，临床表现为发热、上呼吸道粘膜的卡他性炎症以及白细胞减少。病程1周左右，幼驹可达10d以上，妊娠毋马感染本病时易发生流产和产下弱驹，弱驹产下后多在48h内死亡，流产和弱驹死亡率可达80％以上。[0003]本病广泛发生于世界各地，美国、英国、日本、澳大利亚、新西兰、意大利、波兰、瑞典、比利时、爱尔兰、挪威、瑞士、葡萄牙、西班牙、法国、德国、匈牙利、加拿大、南非、巴西、阿根廷、印度、马来西亚以及我国的台湾省和香港特别行政区等50多个国家和地区均有报导，给世界养马业带来很大危害、多数国家已将本病例为养马业重点防制疫病之一。世界动物卫生组织将马鼻肺炎列为须通报动物疫病。[0004]在大量饲养马匹进行传统耕作或以之作为农业经济一部分的国家中，EHV-1和EHV-4这两种病毒感染呈地方性流行。从马以外的其它马属动物，如斑马、亚洲野驴和驴，已经分离到与EHV1/4亲缘关系极为密切的疱疹病毒.也可见到EHV-1感染非马属动物的个别病例，如感染牛引起流产，美洲驼引起视神经疾病和失明等。目前，尚无证据证明这两种疱疹病毒对人有感染性。马鼻肺炎的呼吸道疾病虽说可造成很大的经济损失，但最大的威胁却是给种马、赛马或娱乐马带来的潜在的流产和神经疾患后遗症。国内于1980年从流产的马胎儿中分离到了病毒(但未区分是EHV-1还是EHV-2)，并对部分省区的马匹进行了普查，总阳性率为49.9％，证明了本病在我国的存在。[0005]人类基因组测序已经完成，丰富的信息加深了我们对基因差异及其与疾病和疾病治疗关系的理解。越