云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112410362A(43)申请公布日2021.02.26(21)申请号202011228805.3C12Q1/6851(2018.01)(22)申请日2020.11.06(71)申请人浙江万里学院地址315100浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号(72)发明人王文静吴月燕(74)专利代理机构宁波奥圣专利代理有限公司33226代理人谢潇(51)Int.Cl.C12N15/60(2006.01)C12N9/88(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12Q1/6895(2018.01)权利要求书2页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用(57)摘要本发明公开了云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用，该云锦杜鹃花TPS基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，全长氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明首次从云锦杜鹃花中克隆得到杜鹃花萜烯合酶基因RhTPS，该基因为杜鹃花花香形成的关键基因之一，可以通过转基因等生物技术方法培育有香型杜鹃花，为今后利用基因工程技术改良杜鹃花品质提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。本发明为后续云锦杜鹃花瓣TPS基因的确切功能和参与的萜烯类化合物代谢调控途径等的研究奠定基础。CN112410362ACN112410362A权利要求书1/2页1.云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长核苷酸序列为SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个碱基且具有萜烯合酶活性的基因序列。4.云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。5.根据权利要求4所述的云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长氨基酸序列为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有萜烯合酶活性的由SEQIDNO.3衍生的蛋白质。6.用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物组，其特征在于，该引物组包括TPS-F1、TPS-R1、TPS-F2、TPS-R2、TPS-F3和TPS-R3，其中TPS-F1和TPS-R1用于扩增SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，TPS-F2和TPS-R2用于扩增SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，TPS-F3和TPS-R3为根据SEQIDNO.1所示的核苷酸序列设计并用于qRT-PCR扩增的核苷酸序列，该引物组的序列如下：TPS-F1：CTCATTGACWCWATKCAAMGGY；TPS-R1：CTTRGAAGTKCCCAAATCATCA；TPS-F2：CCAGGTCCATCCACCACTTGGCTAGTTCTTGTA；TPS-R2：ACGCTTGCCTCTTGCTAGGGTCTCCGATAA；TPS-F3：CGCCAGAACTTTCAGTGTCAAGCATTT；TPS-R3：TCGTGCTTCTAACCTCGGCATTCT。7.云锦杜鹃花TPS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取云锦杜鹃花花瓣总RNA，分别用质量浓度1.5％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪测定总RNA的完整性和浓度，按照TransScriptReverseTranscriptase反转录试剂盒的说明书合成cDNA第一链；步骤二、从GenBank中下载与杜鹃花属植物亲缘关系相近植物的TPS基因全长序列，采用ClustalW进行多序列比对，在同源性较高的序列利用Primer5.0设计简并引物TPS-F1和TPS-R1，引物组TPS-F1和TPS-R1的序列为：TPS-F1：CTCATTGACWCWATKCAAMGGY；TPS-R1：CTTRGAAGTKCCCAAATCATCA；步骤三、以cDNA第一链为模板，利用简并引物TPS-F1和TPS-R1进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应的反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，3