检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物、探针及其方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103725794103725794A(43)申请公布日2014.04.16(21)申请号201310424239.7G01N21/64(2006.01)(22)申请日2013.09.17(71)申请人广西壮族自治区动物疫病预防控制中心地址530001广西壮族自治区南宁市西乡塘区友爱北路51号(72)发明人施开创张步娴官家明邹联斌胡杰陆文俊莫胜兰屈素洁粟艳琼李军(74)专利代理机构广西南宁汇博专利代理有限公司45114代理人朱萍球(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)权利要求书2页权利要求书2页说明书10页说明书10页C12N15/11(2006.01)序列表2页序列表2页附图1页附图1页(54)发明名称检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物、探针及其方法(57)摘要本发明公开了检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物、探针及其方法。检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物和探针，引物包括AM-PRRSV引物对和EU-ORF1a引物对，探针包括AM-V-PRRSV-P探针、AM-C-PRRSV-P探针、EU-PRRSV-P探针；检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法,该方法利用引物和探针进行多重荧光定量RT-PCR扩增，扩增后收集荧光信号，出现扩增曲线者为阳性。其特征在于，所述的RT-PCR扩增体系包括所述的引物和探针。本发明可同时检测PRRSV美洲型经典毒株、HP-PRRSV以及欧洲型毒株，具有特异性强、敏感性高、自动化程度高、快速简便等优点。CN103725794ACN10372594ACN103725794A权利要求书1/2页1.检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物和探针，引物包括AM-PRRSV引物对和EU-ORF1a引物对，探针包括AM-V-PRRSV-P探针、AM-C-PRRSV-P探针、EU-PRRSV-P探针，其特征在于，所述AM-PRRSV引物对的上游引物核苷酸序列为5'-GAGTGGGTCGGCTCCAGTTC-3'，下游引物核苷酸序列为5'-GCCTCATATTCCGTCTGTGA-3'；所述EU-ORF1a引物对的上游引物核苷酸序列为5'-CGACATACTGCTTCTTAC-3'，下游引物核苷酸序列为5'-CGGTATTTGAATAACCACA-3'；所述的AM-V-PRRSV-P探针为5'-F-TAGAACTGTGACAACAACGCTGA-Q-3'；所述的AM-C-PRRSV-P探针为5'-F-AACTGTGTCTCGACCGGTGAC-Q-3'；所述的EU-PRRSV-P探针为5'-F-CCTTGCTATGACCAGTTGTGTTCC-Q-3'；其中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。2.根据权利要求1所述的检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述的F为FAM、TAMRA、JOE、HEX或TET中的任一种；所述的Q为BHQ或MGB中的任一种。3.根据权利要求1~2任一项所述的检测PRRSV的荧光定量RT-PCR引物和探针，其特征在于，所述的AM-V-PRRSV-P探针的F为FAM，Q为BHQ1；所述的AM-C-PRRSV-P探针的F为JOE，Q为BHQ1；所述EU-PRRSV-P探针的F为TAMRA，Q为BHQ2。4.一种检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法,该方法利用引物和探针对阳性对照样品、检测样品进行荧光RT-PCR扩增，扩增后收集荧光信号，其特征在于，所述的RT-PCR扩增反应体系包括权利要求1~3任一项所述的引物和探针。5.根据权利要求4所述检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法,其特征在于，所述RT-PCR扩增体系还包括PremixExTaqTM试剂、ROX参比染料、模板、灭菌双蒸水。6.根据权利要求4~5任一项所述检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法,其特征在于，当RT-PCR扩增体系为阳性对照样品反应时，所述的模板为p-C-Nsp2质粒、p-V-Nsp2质粒和p-E-ORF1a质粒混合液标准品；当RT-PCR扩增体系为检测样品反应时，所述的模板为从疑似PRRSV感染的动物组织或血清抽提的总RNA反转录获得的cDNA。7.根据权利要求6所述的检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述p-C-Nsp2质粒为含有美洲型经典毒株VR-2332株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-V-Nsp2质粒为含有美洲型变异毒株JXA1株Nsp2基因的阳性标准质粒；所述p-E-ORF1a质粒为含有欧洲型LV毒株ORF1a基因的阳性标准质粒。8.根据权利要求7所述检测PRRSV病毒的荧光定量RT-