一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115852052A(43)申请公布日2023.03.28(21)申请号202211419828.1C12Q1/6851(2018.01)(22)申请日2022.11.14C12R1/94(2006.01)(71)申请人云南省农业科学院花卉研究所地址650200云南省昆明市盘龙区北京路2238号申请人云南大学(72)发明人王丽花孙爱青吴学尉许凤瞿素萍张艺萍杨秀梅张丽芳蒋亚莲苏艳李金泽(74)专利代理机构北京隆达恒晟知识产权代理有限公司11899专利代理师申文涛(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法(57)摘要本发明涉及一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法，属于病原体检测技术领域。本发明提供了一种高效检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法，包括上游引物序列、下游引物序列和探针序列，还提供了CymRSV的实时荧光定量PCR检测方法。本发明基于CP基因区域设计了一套特异性实时荧光定量PCR引物对和探针，建立了CymRSV的实时荧光定量PCR检测方法，特异性好，灵敏度高达10copies，重复性实验结果显示本方法具有良好的稳定性，实现了CymRSV的微量检测，可为CymRSV的早检测早防控提供高效可行的检测方法，对工厂化生产健康无毒、观赏价值高的蝴蝶兰等兰属优质种苗具有重要意义。CN115852052ACN115852052A权利要求书1/1页1.一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合，其特征在于：所述检测组合包括引物和探针；所述上游引物CymRSV‑F和下游引物CymRSV‑R的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：上游引物CymRSV‑F：5’‑CGCAGTGGGTGACTTATT‑3’；下游引物CymRSV‑R：5’‑CGTCGTGGCTGTGGTAG‑3’；所述探针的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示：探针CymRSV‑P(Cy5)：5’‑CACAGTAACCTTCTACGAACCGCAACCG‑3’；所述探针根据所述的引物设计得到，所述探针5’端用Cy5荧光基团修饰，3’端用BHQ3淬灭基团修饰。2.根据权利要求1所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）提取待测样品中的RNA；（2）以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，获得cDNA；（3）将步骤（2）中获得的cDNA作为待测模板，并使用权利要求1所述的引物探针组合对所述待测模板进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到扩增曲线，扩增曲线线性方程为y＝‑3.332x+40.371（E=99.6%，R2=0.999）；（4）根据步骤（3）得到的扩增曲线判断样品是否为阳性，具体判断方法如下：当待检样品Ct值≤35，判为阳性；当待检样品无扩增曲线时，判为阴性；当待检样品35＜Ct值≤40，判为可疑，需重新检测，若重新检测Ct还是在此范围之内或小于35判断样品为阳性，否则判断样品为阴性。3.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μ1计，所述上游引物的用量为20μM0.5μl。4.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μ1计，所述下游引物的用量为20μM0.5μl。5.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的体系组分以总体积25μ1计，所述探针的用量为10μM1μl。6.根据权利要求2所述的一种检测CymRSV的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集Cy5荧光信号。7.根据权利要求1所述的一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合以及权利要求2~6所述的一种检测CymRSV的方法在定量检测或辅助检测可能感染CymRSV的样品和制备定量检测或辅助检测可能感染CymRSV的产品中的应用。2CN115852052A说明书1/7页一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法技术领域[0001]本发明属于病原体检测技术领域，具体的说，涉及一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法。背景技术[0002]CymRSV（Cymbidiumringspotvirus）通常称为大花蕙兰环斑病毒（美国ATCC），也称为兰花环斑病毒、建兰环斑