重组菌株及其制备方法、应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105734004A(43)申请公布日2016.07.06(21)申请号201610119394.1C12R1/15(2006.01)(22)申请日2016.03.02(83)生物保藏信息CGMCCNo.119422015.12.25(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人胡丹赵丽彬方真刁刘洋毛贤军(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书9页C12P13/08(2006.01)序列表7页附图4页(54)发明名称重组菌株及其制备方法、应用(57)摘要本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法、应用。本发明所构建的L-赖氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中L-赖氨酸的有效积累，且具有较高的糖酸转化率。本发明从头构建的基因工程菌株，避免了随机突变带来的副作用，有利于实现高产酸和高转化率，具有广泛的工业应用前景。CN105734004ACN105734004A权利要求书1/1页1.重组菌株，其特征在于，其包含编码突变lysC蛋白质的突变lysC基因；所述突变lysC蛋白质具有T311I突变。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，还包括编码突变hom蛋白质的突变hom基因；所述突变hom蛋白质具有V59A突变。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，还包括突变dapA基因、突变dapB基因、突变ddh基因中的一个或多个；所述突变dapA基因、突变dapB基因、突变ddh基因为增强dapA基因、dapB基因和/或ddh基因的表达。4.根据权利要求1至3任一项所述的重组菌株，其特征在于，还包括编码突变pyc蛋白质的突变pyc基因；所述突变pyc蛋白质具有P458S突变。5.根据权利要求1至4任一项所述的重组菌株，其特征在于，还包括降低丙酮酸脱氢酶活性的aceE的启动子序列；所述aceE的启动子序列如SEQIDNo.27所示；还包括编码突变gnd蛋白质的突变gnd基因；所述突变gnd蛋白质具有S361F突变。6.根据权利要求1至5任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述突变通过sacB重组系统引入；其出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。7.根据权利要求1至6任一项所述的重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.11942。8.根据权利要求1至7任一项所述的重组菌株发酵生产赖氨酸中的应用。9.一种保藏编号为CGMCCNo.11942的L-赖氨酸基因工程生产菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株；步骤A、通过在lysC中引入点突变T311I，解除天冬氨酸激酶的反馈抑制；步骤B、通过在hom中引入点突变V59A，弱化高丝氨酸脱氢酶；步骤C、通过增加拷贝数，增强dapA、dapB、ddh的表达，进而增强其编码的酶的活性；步骤D、通过在pyc中引入点突变P458S，解除丙酮酸羧化酶的反馈抑制；步骤E、通过改变aceE的启动子序列，弱化丙酮酸脱氢酶；步骤F、通过在gnd中引入点突变S361F，解除6-磷酸葡糖酸脱氢酶的反馈抑制。10.一种发酵生产赖氨酸的方法，其特征在于，以如权利要求1至7任一项所述的重组菌株为发酵菌株。2CN105734004A说明书1/9页重组菌株及其制备方法、应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法、应用。背景技术[0002]谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产L-氨基酸、核苷酸及其他有机酸。[0003]L-赖氨酸是世界上第二大氨基酸生产品种,广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。其中约90％用于饲料工业，10％用于食品和医药行业。用于动物饲料添加剂，L-赖氨酸可帮助机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。[0004]谷氨酸棒杆菌合成L-赖氨酸，从L-天冬氨酸开始，经过六步酶催化得到L-赖氨酸。L-赖氨酸的产率与生物合成途径中的酶活性及代谢流的分布相关，通过增强末端合成途径的酶活性，或改变中央代谢流方向，以及增加还原力的供给，都利于菌株高产L-赖氨酸。[0005]天冬氨酸激酶(lysC编码)作为末端合成途径的第一个关键酶，受到该途径产物L-赖氨酸的反馈抑制。J.Ohnishi等(J.Ohnishi.ApplMicrobiolBiotechnol.2002,58:217-223)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌株，通过引入