重组菌株及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105695383A(43)申请公布日2016.06.22(21)申请号201610119402.2C12P13/14(2006.01)C12R1/15(2006.01)(22)申请日2016.03.02(83)生物保藏信息CGMCCNo.119412015.12.25(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人马雯雯胡丹程江红毛贤军刁刘洋(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/74(2006.01)权利要求书1页说明书13页序列表12页附图2页(54)发明名称重组菌株及其应用(57)摘要本发明涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其应用。实验结果表明，野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869在未经改造前基本不产谷氨酸，本发明提供的菌株MHZ-0112-1谷氨酸的产量为4.7g/L；MHZ-0112-2谷氨酸的产量为18.5g/L；菌株MHZ-0112-4和MHZ-0112-5谷氨酸的产量分别为23.4g/L和26.4g/L。在单独利用强启动子Psod表达gdh基因，谷氨酸产量提高约1.8倍，单独利用Ptuf启动子表达gltA基因将CS酶活增加了4倍，谷氨酸产量提高至30.8g/L；将两个基因同时进行过表达后，谷氨酸产量继续提高至35.5g/L，转化率达到约59％。CN105695383ACN105695383A权利要求书1/1页1.重组菌株，其特征在于，其包含编码突变yggB蛋白质的突变yggB基因。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述突变yggB蛋白质为A106氨基酸处具有突变；所述突变yggB蛋白质具有A106V突变；还包括编码降低ODHC活性的突变odhA基因；所述突变odhA基因为对odhA基因进行失活改造。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，还包括突变gdh基因；所述突变gdh基因为过表达gdh基因；还包括突变gltA基因；所述突变gltA基因为过表达gltA基因。4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述过表达gdh基因或过表达gltA基因中的所述过表达通过构建过表达载体或者插入启动子的方式增强所述基因的表达。5.根据权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述过表达载体为pEC-gdh或pEC-gltA；所述启动子为sod或tuf。6.根据权利要求1至5任一项所述的重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.11941。7.根据权利要求1至6任一项所述的重组菌株发酵生产谷氨酸中的应用。8.根据权利要求1至6任一项所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869为出发菌株；步骤1、在yggB中引入点突变A106V；步骤2、对odhA基因进行失活改造；步骤3、过表达gdh基因；步骤4、过表达gltA基因。9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤3或步骤4中所述过表达通过构建过表达载体或者插入启动子的方式增强所述基因的表达；所述过表达载体为pEC-gdh或pEC-gltA；所述启动子为sod或tuf。10.一种发酵生产谷氨酸的方法，其特征在于，以如权利要求1至6任一项所述的重组菌株为发酵菌株。2CN105695383A说明书1/13页重组菌株及其应用技术领域[0001]本发明涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其应用。背景技术[0002]谷氨酸(Glutamicacid)，其学名为2-氨基-5-梭基戊酸，是构成蛋白质的20种常见氨基酸之一。谷氨酸是目前世界上产量最大的氨基酸品种，全球每年对谷氨酸的需求量达到2500万吨。L-谷氨酸是谷氨酸的左旋体，其具有增鲜、降低血氨、改善中枢神经系统、改善儿童智力发育、扩张血管、增强血液循环、促进花穗发育等功能，并且可以生产许多重要的下游产品，如L-谷氨酸钠、L-苏氨酸、聚谷氨酸等，被广泛应用于食品、医药、人造制革、化妆品、农业等行业。[0003]谷氨酸的制备起始于18世纪。1866年德国化学家从小麦面筋的水解物中提取得到谷氨酸，1957年日本率先从自然界分离得到谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，开启了利用糖和氨发酵生产谷氨酸的研究，因发酵法具有原料成本低、反应条件温和、可大规模生产等优点，目前仍是谷氨酸生产的主要方法。[0004]谷氨酸棒杆菌是一种好氧、不产抱子的革兰氏阳性细菌，基因组大小为3282kb，它不仅能利用葡萄糖为唯一碳源进行生长，而且能利用包括乙酸和唬拍酸在内的其它有机酸和碳水化合物为唯一碳源或混合碳源进行生长。谷氨酸棒杆