一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101940159A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101940159A(43)申请公布日2011.01.12(21)申请号201010215828.0(22)申请日2010.06.30(71)申请人中国科学院华南植物园地址510650广东省广州市天河区五山乐意居(72)发明人吴国江李美茹(74)专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001代理人余炳和(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)C12N15/82(2006.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法(57)摘要本发明提供一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法。该方法是将携带目的基因的表达载体转化农杆菌，将此农杆菌与通过植物组织培养技术培养的天山雪莲外植体共培养，使目的基因插入到外植体基因组中，经抗性素筛选，再通过分子检测方法对抗性愈伤或者抗性芽进行检测，含有目的基因的抗性株即为转化株，将此转化株通过芽增殖途径可以获得大量的转化株，转化株经栽培后，即可获得转基因天山雪莲新品种。本发明可在5个月内获得大量的转基因的天山雪莲新品种，满足现时对天山雪莲优良株系培育筛选、生物学和药学的学术研究的迫切需要，为天山雪莲种质资源创新提供珍贵的遗传材料，对天山雪莲可持续发展具有显著的生态、经济和社会效益。CN10945ACCNN110194015901940162A权利要求书1/2页1.一种快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：a)外植体的培养：该外植体为天山雪莲实生苗的叶片或者再生芽的叶片、叶柄或者根茎结合部；所述的再生芽是通过以下方法制备的：将天山雪莲种子灭菌后，接种到不含激素的1/2MS基本培养基中，24±1C下，黑暗下培养，待种子萌发后，将其移至光下培养，切取培养的天山雪莲的叶片，接种于芽诱导培养基上，诱导出从生芽，然后将丛生芽转移至从生芽伸长培养基，光下培养获得再生芽；b)将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌菌液中，该表达载体含有潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)作为筛选基因，然后将外植体移至共培养基中共培养，24±1℃下，黑暗条件下培养，然后去除外植体上的根癌农杆菌，至抗性愈伤筛选培养基中，24±1℃下，黑暗条件下培养，再将抗性愈伤移至抗性芽再生培养基中，24±1℃下，光下培养，待长出抗性芽，将抗性芽接种到抗性芽伸长培养基中，光下培养，切取伸长的抗性芽接种到抗性芽生根培养基中，光下培养，诱导生根；c)转基因植株的分子检测：利用表达载体上的筛选标记基因、报告基因或者目的基因的序列进行PCR分子检测法、Southern杂交方法或者RT-PCR检测法，检测抗性愈伤或者抗性芽或者抗性植株是否已是转基因材料；d)转基因植株的移栽：将检测含有目的基因的生根的转基因植株从培养基中取出，洗净，置于灭菌的蛭石中，17±1℃，光下培养，正常生长，得到转基因天山雪莲；所述的芽诱导培养基为每升MS培养基添加1.5mgbenzyladenine(BA)、0.1mga-Naphthaleneaceticacid(NAA)，pH为5.8，所述的丛生芽伸长培养基为每升MS培养基添加0.2mgBA、0.01mgNAA，pH5.8，所述的共培养基为每升MS培养基添加1mgBA、0.1mgNAA、0.1mg2，4-Dichlorophenoxyaceticacid(2，4-D)、10mg乙酰丁香酮，pH为5.5，所述的抗性愈伤筛选培养基为每升MS培养基添加1mgBA、0.1mgNAA、0.1mg2，4-D、15～30mg潮霉素、500mg头孢霉素，pH为5.8，所述的抗性芽再生培养基为每升MS培养基添加1.5mgBA、0.1mgNAA、0.25mgGibberellicAcid(GA3)、15～30mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH为5.8，所述的抗性芽伸长培养基为每升MS培养基添加0.2mgBA、0.01mgNAA，15～30mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH5.8，所述的抗性芽生根培养基为每升MS培养基添加0.2mgNAA、15～30mg潮霉素、250mg头孢霉素，pH为5.8。2.根据权利要求1所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特征在于，所述的含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌是通过以下方法构建的：将目的基因插入表达载体启动子之后，通过冻融法将构建好的携带目的基因的表达载体导入根癌农杆菌，经抗性筛选，获得含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌。3.根据权利要求2所述的快速获得大量转基因天山雪莲新品种的分子育种方法，其特征在于，所述的表达载体的启动子为玉米的ubiquitin启动