一种从扦插苗获得转基因百脉根新品种的分子育种方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115232832A(43)申请公布日2022.10.25(21)申请号202210760388.XA01H4/00(2006.01)(22)申请日2022.06.30(71)申请人中国科学院华南植物园地址510650广东省广州市天河区兴科路723号(72)发明人陈雅平姜华武尹业虎吴国江(74)专利代理机构广州智斧知识产权代理事务所(普通合伙)44649专利代理师朱双(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N15/60(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/54(2018.01)权利要求书2页说明书6页附图3页(54)发明名称一种从扦插苗获得转基因百脉根新品种的分子育种方法(57)摘要本发明公开了一种从扦插苗获得转基因百脉根新品种的分子育种方法。本发明方法根据育种目的构建目的基因的植物表达载体，以扦插苗脱毒后诱导的再生芽叶片作为遗传转化受体，通过根癌农杆菌介导方法将目的基因导入百脉根基因组，在转化愈伤诱导、转化芽再生时应用潮霉素筛选转化体，通过PCR、Southern杂交、GUS染色等方式检测证明所获得的抗性株均为转基因植株，被成功地移栽到土壤中。应用本发明方法将不局限于遗传转化起始材料的数量和育性，并且5个月内即可获得大量的转目的基因的百脉根新品种，为百脉根种质资源创新提供珍贵的遗传材料。CN115232832ACN115232832A权利要求书1/2页1.一种从扦插苗获得转基因百脉根新品种的分子育种方法，其特征在于，包括以下步骤：a.外植体的培养：切取百脉根枝条并剪去叶片，经脱毒后，将枝条切成小段，每个小段上至少包含一个节点，将小段枝条扦插到再生芽诱导培养基中培养，进行再生芽诱导；待再生芽长至3‑5cm长，取再生芽上的小叶叶片切成0.5×0.5cm大小的小块作为外植体；b.目的基因转化外植体及再生：将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌菌液中20min，取出外植体去除多余菌液；然后将外植体移至共培养基中，黑暗下培养5d；冲洗干净后将外植体移至抗性愈伤筛选培养基培养，诱导出抗性愈伤；将抗性愈伤移至抗性芽诱导培养基中培养，每2周更新培养基，获得再生的抗性芽；然后切取抗性芽接种到根诱导培养基中，培养诱导生根，获得抗性植株；c.分子检测：利用表达载体上的筛选标记基因、报告基因或者目的基因的序列进行PCR分子检测、Southern杂交检测或者RT‑PCR检测，检测抗性愈伤、抗性芽或者抗性植株是否为转基因材料；d.转基因植株的移栽：将检测含有目的基因的抗性植株从培养基中取出，移栽至栽培基质，得到转基因百脉根。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a的脱毒，其步骤如下：将百脉根枝条用体积分数75％乙醇水溶液浸泡30s，然后用无菌水冲洗干净，将枝条移至含有终浓度为体积分数0.1％的吐温20和终浓度为质量分数2％的次氯酸钠的无菌水溶液中浸泡15min，之后用无菌水冲洗5～6次。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将外植体浸泡于含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌菌液中20min，其步骤如下：先将含有携带目的基因的表达载体的根癌农杆菌悬浮在含有终浓度为2mg/L乙酰丁香酮的pH5.2的1/2B5培养基中，常规培养至菌液OD600为0.4～0.5，然后将外植体浸泡于菌液中，浸泡时间为20min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中的冲洗干净是用含有终浓度为体积分数0.1％的吐温20的无菌水溶液冲洗共培养后的外植体5～6次，然后将外植体置于无菌纸上吸干水。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的再生芽诱导培养基为：1/2B5培养基添加8g/L琼脂、0.2mg/L6‑BA，pH为5.5。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的共培养基为：1/10B5培养基添加8g/L琼脂、0.5mg/L6‑BA、0.05mg/LNAA、5mMMESbuffer和2mg/L乙酰丁香酮，pH为5.5；所述的抗性愈伤筛选培养基为：1/2B5培养基添加8g/L琼脂、1mg/L6‑BA、0.1mgNAA、20mg/L潮霉素和500mg/L头孢霉素，pH为5.5；所述的抗性芽诱导培养基为：1/2B5培养基添加8g/L琼脂、0.2mg/L6‑BA、10mM(NH4)2SO4、10mMMES、20mg/L潮霉素和300mg/L头孢霉素，pH为5.5；所述的根诱导培养基为：1/2B5培养基添加8g/L琼脂、10g/L蔗糖和0.5mg/LNAA，pH5.5。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a和b中的培养温度为24±1℃，除共培养外的其他组织培