一种快速高效的获得转基因甘薯的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115747250A(43)申请公布日2023.03.07(21)申请号202211517428.4(22)申请日2022.11.30(71)申请人中国农业大学地址100193北京市海淀区圆明园西路2号(72)发明人高少培刘庆昌翟红何绍贞张欢赵宁张雯(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245专利代理师莫舒颖(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/84(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/00(2018.01)权利要求书1页说明书6页附图5页(54)发明名称一种快速高效的获得转基因甘薯的方法(57)摘要本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种快速高效的获得转基因甘薯的方法包括如下步骤：取带有若干侧枝的甘薯茎段，去除近根端侧枝以在茎节处形成创口，环绕创口所在茎节周围扎孔，浸入含有外源质粒的农杆菌菌液进行共培养，种植共培养后的茎段获得薯块，对所述薯块进行转基因阳性鉴定，所得阳性薯块即转基因甘薯。通过将有创口和扎有孔的茎段浸入含有外源质粒的农杆菌菌液共培养完成快速的遗传转化，直接种植处理后的茎段即可筛选获得转基因甘薯，无需通过愈伤组织阶段，比传统方法节省至少约五个月的时间。本发明方法获得的转基因甘薯阳性率稳定，且高于传统方法的阳性率。本发明方法的应用将大幅度推动甘薯生物技术研究。CN115747250ACN115747250A权利要求书1/1页1.一种获得转基因甘薯的方法，其特征在于：包括如下步骤：取带有若干侧枝的甘薯茎段，去除近根端侧枝以在茎节处形成创口，环绕创口所在茎节周围扎孔，浸入含有外源质粒的农杆菌菌液进行共培养，种植共培养后的茎段获得薯块，对所述薯块进行转基因阳性鉴定，所得阳性薯块即转基因甘薯。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述取带有若干侧枝的甘薯茎段，去除近根端侧枝，为取含有茎尖及其下5‑9个侧枝的甘薯茎段，仅保留近稍端的1～2个侧枝及叶片，去除其它近根端侧枝。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述茎节周围为茎节上下1cm内的区域。4.根据权利要求1‑3任一所述的方法，其特征在于：所述扎孔，以注射器针头扎孔。5.根据权利要求1‑4任一所述的方法，其特征在于：所述扎孔，每个茎节周围扎6～8个孔。6.根据权利要求1‑5任一所述的方法，其特征在于：所述含有外源质粒的农杆菌为将外源质粒转入农杆菌获得，所述农杆菌为发根农杆菌或根癌农杆菌。7.根据权利要求1‑6任一所述的方法，其特征在于：所述发根农杆菌为K599，所述根癌农杆菌为EHA105。8.根据权利要求1‑7任一所述的方法，其特征在于：所述浸入含有外源质粒的农杆菌菌液为将所述创口和所述孔都浸没到菌液中。9.根据权利要求1‑8任一所述的方法，其特征在于：所述共培养的时长为8小时以上。10.根据权利要求1‑8任一所述的方法，其特征在于：所述种植共培养后的茎段，仅将被菌液侵染的茎段种入大田，其余部分露在土壤外。2CN115747250A说明书1/6页一种快速高效的获得转基因甘薯的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域中一种快速高效的获得转基因甘薯的方法。背景技术[0002]甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)又称番薯、红薯、地瓜等。甘薯适应性强，是世界上重要的粮食作物，同时也是饲料、工业原料、生物质能源作物。甘薯在世界上100多个国家和地区中均有种植。中国是目前世界上最大的甘薯生产国。甘薯是世界卫生组织、美国公共利益研究所推荐的食品，其独特的保健防癌作用得到了公认。此外，甘薯是加工产品丰富的原料作物，特别适合产业化开发,为淀粉、食品、发酵等加工业的发展提供了充足的原料。适度发展甘薯产业，有利于保障国家粮食安全，提高人民健康水平。[0003]随着生物技术的快速发展，利用遗传转化技术，将目标基因转入甘薯中，是目前创制甘薯新种质的有效途径。目前常用的获得转基因甘薯的方法是利用根癌农杆菌侵染甘薯愈伤组织经抗性筛选、分化、再生进而形成转基因植株。由于获得甘薯愈伤组织需要的时间长，从甘薯茎尖中分离茎尖分生组织经暗培养愈伤组织扩繁至少需要三个月。甘薯愈伤组织的生长需要严格无菌，很多研究室无法建立稳定的甘薯愈伤悬浮培养体系；此外，获得转基因甘薯的时间长，愈伤组织获得后用根癌农杆菌对其进行侵染、筛选、暗培养、脱分化、成苗，这又需要至少约五个月的时间。成苗以后进行驯化，最后才能栽种到大田中，获得转基因薯块。该方法所需时间长且工作量较大，严重阻碍甘薯基础生物学的研究。发明内容[0004]本发明所要解决的技术问题是如何提高甘薯转基因的效率，尤其是缩短周期和提高阳性率。[0005]为解决上述问题，本发明提供一种快速高效的获得转基