一种快速获得萝卜转基因材料的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114958904A(43)申请公布日2022.08.30(21)申请号202210536365.0(22)申请日2022.05.20(71)申请人南京农业大学地址210095江苏省南京市玄武区卫岗1号南京农业大学园艺学院(72)发明人王燕王爽易小芳应佳丽董俊辉柳李旺徐良(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)A01H5/06(2018.01)A01H6/20(2018.01)C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书7页序列表2页附图3页(54)发明名称一种快速获得萝卜转基因材料的方法(57)摘要本发明涉及一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括：对萝卜种子进行消毒种植无菌苗；活化携带目的基因的发根农杆菌；制备侵染液；获取无根苗外植体并浸入菌液进行侵染；经过共培养和脱菌培养30d后，通过表型筛选、PCR检测和qRT‑PCR分析鉴定阳性毛状根；切取阳性毛状根放置于愈伤组织培养基上诱导愈伤组织，获得转基因愈伤组织。本发明提高了发根农杆菌诱导萝卜毛状根的效率，缩短了发根时间，成功诱导了转基因愈伤组织，能够进行萝卜部分本体基因功能验证。CN114958904ACN114958904A权利要求书1/2页1.一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对萝卜种子进行消毒，接种到MS培养基上，获得无菌苗；(2)携带目的基因的发根农杆菌菌液活化与侵染液制备；(3)外植体制备与侵染；(4)共培养、脱菌培养及毛状根诱导；(5)根据表型或载体荧光标记筛选转基因毛状根；(6)DNA、RNA提取和反转录，PCR检测和qRT‑PCR分析；(7)将转基因毛状根切成0.5em的小段接种至愈伤组织培养基上诱导转基因愈伤组织。2.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(1)中，消毒方式为采用75％的酒精消毒1.5min，8％次氯酸钠消毒10min，随后用无菌水冲洗3次；MS培养基成分为：41.74g/LMS(含琼脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))；无菌苗于25℃，光照时长为16h/d的条件下培养。3.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(2)中含有目的基因的发根农杆菌菌液保存在‑80℃冰箱中，活化农杆菌的培养基为：20g/LLB+15g/L琼脂+100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)+50mg/L链霉素(Streptomycinsulfate，Str)；摇菌时培养基为：20g/LLB+100mg/LKan+50mg/LStr；侵染液制备时，采用1/2MS液体培养基，将菌液OD600值调节至1.0，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮(AS)，侵染过程在28℃，220rmp摇床中进行；1/2MS液体培养基的成分为4.6g/L1/2MS+30g/L蔗糖。4.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(3)中取6‑7d苗龄无菌苗，从生长点向下1cm处快速切断获得无根苗外植体，将无根苗浸入OD600＝1.0的菌液中侵染10min，用无菌水冲洗3次，随后在无菌滤纸上完全晾干。5.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(4)中共培养培养基为41.74g/LMS培养基，共培养在黑暗条件下进行，时间为2d，；脱菌培养基为41.74g/LMS+300mg/L头孢噻肟霉素(Cef)，脱菌培养30d左右。6.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(6)提取DNA的方法为CTAB法；DNA检测的PCR反应体系如下：总体积为10μL，其中Taq酶Mix5μL、引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.5μL、模板DNA(20ng/μL)1μL、ddH2O3μL。PCR反应程序：7.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(6)中2CN114958904A权利要求书2/2页RNA提取与反转录方法参照总RNA提取试剂盒(RNAsimpleTotalRNAKit)和反转录试剂盒(ReverseTranscriptionKit)。qRT‑PCR反应体系如下：体系为15μL，其中，2×SYBRgreenreactionmix7μL，引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.56μL，cDNA(20ng/μL)，ddH2O3μL。qRT‑PCR反应程序：8.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(7)中愈伤诱导培养基成分为：41.74g/LMS(含琼脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))+0.75mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)+0.5mg/L萘乙酸(N