一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109479727A(43)申请公布日2019.03.19(21)申请号201910060531.2(22)申请日2019.01.22(71)申请人信阳农林学院地址464000河南省信阳市羊山新区新24大街与北环路交叉口西北(72)发明人岳建华董艳李文杨李露露刘文杰魏真史亚冰(74)专利代理机构上海段和段律师事务所31334代理人李慧郭国中(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图2页(54)发明名称一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法(57)摘要本发明提供了一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，包括：A、取百子莲的叶基部冲洗消毒，去除外部包裹的老叶，并切掉上下两端的组织，得叶片基部组织；B、将叶片基部组织切块后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养；C、将经步骤B培养后获得的愈伤组织块放置在愈伤组织继代培养基上进行继代培养；D、将经步骤C培养后获得的愈伤组织块放置在胚性愈伤组织诱导培养基上进行培养，得含胚性细胞的愈伤组织块。本发明在叶基部组织诱导愈伤组织上成功进行胚性细胞的诱导，愈伤组织诱导率达到了92.60％，胚性细胞诱导率达到76.36％，诱导周期仅为6～7个月。且该胚性细胞诱导成苗较快，避免了长期继代过程，减少了畸形苗发生。CN109479727ACN109479727A权利要求书1/1页1.一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、取百子莲的叶片冲洗消毒，去除外部2～3片包裹的老叶，并切掉上下两端的组织，得叶片基部组织；B、将叶片基部组织切块后接种于愈伤组织诱导培养基中进行培养；C、将经步骤B培养后获得的带有残留叶片组织的愈伤组织块放置在愈伤组织继代培养基上进行继代培养；D、将经步骤C培养后获得的愈伤组织块放置在胚性愈伤组织诱导培养基上进行培养，得含胚性细胞的愈伤组织块。2.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤A中，所述百子莲的叶片为离根茎连接部位0～2.0cm处的叶片；所述百子莲为2～3年生百子莲。3.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤A中，所述冲洗消毒的具体步骤如下：将百子莲的叶片流水冲洗90～150min后置于超净工作台，75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddH2O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH2O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddH2O冲洗3～5次。4.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤B中，所述叶片基部组织切块后的尺寸为0.5～0.8cm；所述培养条件为：温度22～28℃，暗培养25～35天。5.根据权利要求1或4所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤B中，所述愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43g·L-1MS固体培养基、1.5～2.0mg·L-1PIC、2.5～3.5％(w/v)蔗糖、0.8～1.0％(w/v)琼脂，所述培养基的pH为5.8。6.根据权利要求5所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基的制备方法包括以下步骤：每升ddH2O中加入4.43gMS固体培养基干粉，溶解后加入PIC溶液、蔗糖、琼脂，调节pH值为5.8；获得的培养基灭菌处理后分装，冷却凝固。7.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤C中，所述继代培养条件为：温度22～28℃，暗培养，培养周期为55～65d，继代培养2次。8.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤C中，所述愈伤组织继代培养基的组分包括：4.43g·L-1MS固体培养基、1.0～1.5mg·L-1PIC、2％(w/v)蔗糖、1％(w/v)麦芽糖、0.8～1％(w/v)琼脂，pH5.8。9.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤D中，所述培养条件为：温度22～28℃，暗培养55～65d。10.根据权利要求1所述的以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法，其特征在于，步骤D中，所述胚性愈伤组织诱导培养基的组分包括：4.43g·L-1MS固体培养基、1.0～1.5mg·L-1PIC、2％(w/v)葡萄糖、2％(w/v)麦芽糖、0.8～1％(w/v)琼脂，pH5.8。2CN109479727A说明书1/7页一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法技术领域[0001]本发明涉及一种以百子莲叶片作为外植体诱导胚性细胞的方法。背景技术[0002]百