一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备工艺.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102626516A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102626516A(43)申请公布日2012.08.08(21)申请号201210095852.4(22)申请日2012.04.05(71)申请人青岛农业大学地址266109山东省青岛市城阳区长城路700号青岛农业大学(72)发明人单虎秦晓冰张传美黄娟蔡秀磊张启迪(51)Int.Cl.A61K39/39(2006.01)A61K39/104(2006.01)A61P31/04(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书33页页(54)发明名称一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备工艺(57)摘要本发明公开了一种由两种绿脓杆菌菌株制备的水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。将所述绿脓杆菌菌株接种培养基通气扩增培养，收获培养物灭活后按1∶1比例混合，加蜂胶制备水貂蜂胶绿脓杆菌二价灭活疫苗。本发明所述绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗用于预防水貂出血性肺炎免疫效果好，可获得至少五个月的保护期，保护率在80％以上，具有良好的应用前景。CN10265ACN102626516A权利要求书1/1页1.一种水貂绿脓杆菌蜂胶疫苗，其特征在于主剂为绿脓杆菌Pa1株和Pa3株，佐剂为蜂胶。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于疫苗浓度为含菌量100亿CFU/ml，含蜂胶干物质10~15mg/ml。3.权利要求1所述的水貂绿脓杆菌蜂胶疫苗的制备工艺，其特征在于所述的制备工艺包括如下步骤：一、制备菌液，二、制备蜂胶液，三、配置疫苗，取菌液保存液与蜂胶保存液混合成黄色混悬液，分装后密封保存。4.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于制备菌液步骤主要由下述步骤完成：将绿脓杆菌Pa1株和Pa3株加入到含2%胎牛血清的发酵培养基中，37℃培养16-18小时，调整到菌液浓度为200亿~250亿活菌/ml.再加入甲醛溶液使最终浓度为0.5%，放在37℃中灭活24小时制成灭活菌苗备用。5.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于制备蜂胶液步骤主要由以下步骤完成：选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4℃下保存备用。6.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于黄褐色混悬液，密封保存于4-8℃中。7.权利要求1所述的水貂绿脓杆菌蜂胶疫苗的用途，主要是用于水貂绿脓杆菌的免疫。2CN102626516A说明书1/3页一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备工艺技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种疫苗及其制备方法。背景技术[0002]水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年8-11月份水貂换毛季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发送，每年可造成养殖场20%-40%的死亡率，是危害水貂养殖业的中药细菌性传染病。[0003]该病病原为假单胞菌科（Pseudomonadaceae）假单胞菌属（Pseudomonas）中的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginolsa），亦称为绿脓杆菌（Bacteriumpyocyaneum）,为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生色素，使菌落周围琼脂培养基着色。[0004]绿脓杆菌广泛分布于土壤、水和空气中，在正常人与动物肠道和皮肤上亦有存在，也易从外伤、烧伤及尿道感染等发现，能引起人的烧伤感染和患囊性纤维化病人的肺部感染，具有多种致病因子而且有强侵袭力。[0005]水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生耐药性，因此需要有效的疫苗来预防，国外有报道将细菌细胞壁提取物（JAMESE.PENNINGTON,1979）加类毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。发明内容[0006]步骤1：将铜绿假单胞菌菌株Pa1株和铜绿假单胞菌菌株Pa3株分别接种于发酵培养基培养，调整菌数为200-250亿CFU/mL按比例1：1混合；步骤2：灭活步骤1所得混合培养物；步骤3：在步骤2所得培养物中添加蜂胶佐剂，即得所述水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗。[0007]作为优选，步骤1所述接种为按发酵培养基体积的2%接种菌株。[0008]作为优选，步骤1所述培养为在37℃通气搅拌培养12-16h，控制绿脓杆菌的培养时间在16h