一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105543404A(43)申请公布日2016.05.04(21)申请号201610133952.X(22)申请日2016.03.10(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350001福建省福州市湖东路312号国检广场(72)发明人张体银刘蓓郑腾白泉阳王武军张志灯于师宇林素洁(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页(54)发明名称一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法(57)摘要本发明公开了一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，属于生物技术领域。所述PCR反应体系中有一对特异性引物Api-F和Api-R，上述引物能够从感染熊蜂孢子虫的熊蜂DNA中特异性扩增一段316bp的片段，从而实现对熊蜂孢子虫的PCR检测。本发明的熊蜂孢子虫PCR检测方法，对全基因合成的熊蜂孢子虫DNA的检测灵敏度可达到1.39fg/μL，具有特异性强，稳定性好，快速准确的特点，可用于进境熊蜂和国内养殖熊蜂体内熊蜂孢子虫的检测，为防止熊蜂孢子虫的传入和国内熊蜂孢子虫病的防控提供可靠的理论和技术依据。CN105543404ACN105543404A权利要求书1/1页1.一种用于检测熊蜂孢子虫的PCR引物，其特征在于：所述的特异性引物对为：上游引物Api-F：5’-AGCGATGGATGTCTTGGG-3’；下游引物Api-R：5’-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3’。2.一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：利用特异性引物对Api-F和Api-R，对待测样品DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出316bp的特异性条带，说明待测样品中含有熊蜂孢子虫，反之则未检出。3.根据权利要求2所述的一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增®反应体系为20μL，包括GoTaqDNA聚合酶0.5μL；200μM的dNTPs2μL；25mM的MgCl21.5μL；5×GoTaqBuffer4μL；浓度为10μM的上游引物Api-F1μL；浓度为10μM的下游引物Api-R1μL；DNA模板2μL；ddH2O8μL。4.根据权利要求2所述的一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR反应条件为：95℃预变性4min，之后95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，循环40次后，72℃延伸10min。5.根据权利要求2所述的一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增产物检测与分析步骤：取6μLPCR扩增产物，在加入0.01%GelRed核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶上电泳后，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物。2CN105543404A说明书1/4页一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法。背景技术[0002]熊蜂孢子虫（Apicystisbombi）属于类锥体纲（Conoidasida）、簇虫亚纲（Gregarinasina）、新簇虫目（Neogregarinorida）、孢子虫属（Apicystis）。熊蜂孢子虫是一种寄生于熊蜂属和西方蜜蜂的原生动物寄生虫，外形与熊蜂微孢子虫类似但较大，孢子呈船型，大小约11.4-14.4μm长，3.6-5.4μm宽。自在芬兰和意大利出现后，这种寄生虫很快传染到欧洲各国，目前国内尚没有熊蜂孢子虫的报道，但这种寄生虫致病力强，如不严格预防，随着商用熊蜂群进出口贸易往来的加大，将对我国熊蜂的饲养和繁育产生巨大影响。[0003]熊蜂孢子虫的检验主要是解剖观察和镜检观察，镜检观察主要是取病蜂的脂肪体和中肠组织涂片在甲醇中固定2分钟，0.25%吉姆萨染色8—12小时后，于光学显微镜下观察。镜检观察容易漏检，且易与微孢子虫病、短膜虫病等混淆。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种熊蜂孢子虫的PCR检测方法，以便准确、灵敏、快速、经济地检测进口熊蜂及国内养殖熊蜂蜂群中的熊蜂孢子虫。[0005]本发明提供的熊蜂孢子虫的PCR检测方法，具体步骤如下：利用特异性引物对，对疑似感染熊蜂孢子虫的熊蜂腹部组织DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，如扩增出316bp的熊蜂孢子虫基因片段，则标志着待检测样品为熊蜂孢子虫阳性。[0006]其中，所述特异性引物对为：上游引物Api-F：5’-AGCGATGGATGTCTTGGG-3’；下游引物Api-R：5’-TTCAGCGGGTAACCTTGT-3’。[0007]其中，所述PCR的反应体系如下