一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103409543A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103409543103409543A(43)申请公布日2013.11.27(21)申请号201310362385.1(22)申请日2013.08.19(71)申请人新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址830046新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市南湖北路116号(72)发明人季新成彭武丽王振宝于学辉史茜王科珂员丽娟段晓东(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书11页说明书11页序列表1页序列表1页附图2页附图2页(54)发明名称一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒(57)摘要本发明公开一种牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒，在双重PCR反应体系中引入指示假阴性的内标，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，反应条件为：dNTP浓度为2.0mmol/L，Mg2+浓度为1.0mmol/L，Nc-5、GRA6和PRL三个基因所对应的上下游引物浓度分别为0.125mmol/L、0.5mmol/L和0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶1.5U；扩增条件为95℃5min；95℃30s，58℃45s，72℃30s，30个循环；最后经72℃延伸10min。本发明应用于对牛新孢子虫病与弓形虫病同步检测领域。CN103409543ACN103495ACN103409543A权利要求书1/1页1.一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒按50次反应体系组装由以下成分组成：试剂盒反应体系为，0.5mLPCR扩增试剂混合2+液，包括Tris-HClpH8.4，40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH4)SO420mmol/L、Mg4.0mmol/L、dNTP4.0mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/GRA-R和PRL-F/PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μLTaq酶75U；去离子水1.0mL；所用的检测引物为：（1）新孢子虫检测引物：上游引物（Nc-F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG下游引物（Nc-R）：CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG可以扩增GeneBank登录号为X84238.1，469-690位犬新孢子虫的Nc-5基因特异性核苷酸序列，如SEQIDNO.1；（2）弓形虫检测引物：上游引物（GRA-F）：ATGATACAACCTCCGAAGCG下游引物（GRA-R）：CGTCTTGTGCCCTGTTCTTC可以扩增GeneBank登录号为HM776942.1，265-388位刚地弓形虫的GRA6基因特异性核苷酸序列，如SEQIDNO.2；（3）监控内标检测引物：上游引物（PRL-F）：TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC下游引物（PRL-R）：CAATCTCTATGGCCCTCGA可以扩增GeneBank登录号为AF426315.1，8142-8449位牛催乳素PRL基因特异性核苷酸序列，如SEQIDNO.3。2.如权利要求1所述牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒具体检测方法为：（1）核酸的提取：按照抗凝全血血液基因组DNA提取系统进行操作提取核酸，组织样品经研磨后用DNAZol提取核酸，细胞培养物用DNAZol提取核酸，提取的核酸于-20℃保存备用；（2）内标多重PCR扩增：多重PCR反应条件为：PCR扩增试剂10µL，DNA2µL，TaqDNA聚合酶0.3µL，补去离子水至20uL；扩增条件为：95℃5min；95℃30s58℃45s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；试验检测结束后，用浓度为25g/L的琼脂糖凝胶电泳，80V-100V，60min，观察结果；（3）检测结果分析：被检样品同时扩增出大小为222bp、124bp和308bp的目的条带，表明该样品新孢子虫病和弓形虫病均为阳性；被检样品扩增出大小为308bp电泳条带，且有222bp或124bp任何一条电泳条带，扩增出222bp条带，表明该样品新孢子虫病，扩增出124bp条带，表明该样品弓形虫病，均为阳性；被检样品仅扩增出大小为308bp电泳条带，表明该样品新孢子虫病和弓形虫病均为阴性；被检样品不能扩展出大小为222bp、124bp和308bp中的任意一条电泳条带，表明反应中存在抑制成分，需重新进行检测。2CN103409543A说明书1/11页一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒[0001]技术领域[0002]本发明涉及动物