熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106755495A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201710057647.1(22)申请日2017.01.26(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银郑腾李丹丹白泉阳王武军张志灯于师宇(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图3页(54)发明名称熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒(57)摘要本发明涉及熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒，专用于熊蜂短膜虫的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌水。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对熊蜂短膜虫的检测具有高度特异性，与其它蜂类寄生病原无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到100拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明试剂盒可用于熊蜂短膜虫病的诊断和检测，对该病的防控和及时治疗具有重要意义。CN106755495ACN106755495A权利要求书1/1页1.一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物Cri-F、反向引物Cri-R及TaqMan探针qPCR-P，各引物核苷酸序列如下：正向引物Cri-F：5’-GTTGGGAAAGAGAGTCTA-3’，反向引物Cri-R：5’-GACGAGAAGGAGAGTAAG-3’；TaqMan探针qPCR-P：5’-AACACACAAACAAACCAAACACACA-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。2.根据权利要求1所述的一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：（1）阳性标准品：100μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（2）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用未感染熊蜂短膜虫的健康熊蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR缓冲液625μL，浓度为10μmol/L的正向引物Cri-F和反向引物Cri-R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针qPCR-P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，共计850μL；-20℃保存；（4）ExTaq酶：25μL浓度为5U/μLExTaq酶1支，-20℃保存；（5）无菌水：2mL无菌水2支。2CN106755495A说明书1/4页熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及一种熊蜂短膜虫实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于动物卫生技术领域，适用于熊蜂短膜虫病的检测和诊断。背景技术[0002]熊蜂短膜虫（Crithidiabombi，简称C.bombi）是熊蜂重要的寄生性原虫，属于动鞭毛虫纲（Zoomastigophorea）动质目（Kinetoplastida）锥虫科（Trypanosomatidae）短膜虫属Crithidia，只具锥虫亚目6个发育期中的无鞭毛期和前鞭毛期两个发育期。它是熊蜂最重要的病虫害之一，感染个体寿命缩短，卵巢变小，蜂王巢穴和工蜂存活能力降低，严重影响熊蜂的健康(SkykoffandSchmid-Hempel,1992)，而且感染后症状并不明显，也延误了对该病的治疗。熊蜂短膜虫通过降低寄主熊蜂识别和采集花蜜能力，来改变寄主熊蜂的觅食行为，采集花粉的能力降低60%以上（Otterstatteretal.,2005）。这种觅食行为的变化，对需要其授粉植物的影响是不可预测的；同时，增加的采集能量支出，也影响到整个蜂群的健康（Schmid-Hempeletal.,2007）。通过对我国各地所采到的30份熊蜂样品进行流行病学调查显示，感染率达到了46.7%，感染状况十分严重，另外熊蜂短膜虫在夏季的感染情况是寄主冬季致死率的预测标记（Ravoetetal.,2013），夏季的高流行率预示着蜂群在越冬过程中存在着一定的死亡风险。熊蜂短膜虫病的流行会降低该地区熊蜂的遗传多样性；反过来，熊蜂遗传多样性的降低，又会促进熊蜂短膜虫病的发生，这种相互影响最终给经济和生态带来巨大的危害。[0003]目前对于熊蜂短膜虫的检测主要根据病原形态学特征以镜检法为主，但这种方法需要丰富的临