一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106282418A(43)申请公布日2017.01.04(21)申请号201610960353.5(22)申请日2016.11.04(71)申请人福建农林大学地址350002福建省福州市仓山区上下店路15号(72)发明人黄少康林丽花黄伟峰苏松坤(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊陈彩芳(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书3页序列表1页附图2页(54)发明名称一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法(57)摘要本发明提供的是一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法，所述引物为：CSBV-1-F：TATTCAGGGGGACGCTACAC，CSBV-1-R：GCGTGAGTTGACAGAAAATC；Nc-F：GAGAGAACGGTTTTTTGTTTGAGA，Nc-R：ATCCTTTCCTTCCTACACTGATTG。我们通过引物建立了高灵敏度的二重PCR检测方法，通过提取中肠组织RNA通过PCR同时检测两种病原，具有试剂用量少，且具有高灵敏度和高准确性的优点。该方法同时检测CSBV和Nc的灵敏度可分别低至6与3个拷贝。CN106282418ACN106282418A权利要求书1/1页1.一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测引物，其特征在于：检测中蜂囊状幼虫病的引物为：CSBV-1-F：TATTCAGGGGGACGCTACAC，CSBV-1-R：GCGTGAGTTGACAGAAAATC。2.一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法，其特征在于：所述方法包括如下：（1）提取蜜蜂样品中肠的RNA；（2）用一步法RT-PCR，或先转录成cDNA，再行PCR的方法进行扩增；（3）PCR反应体系25μL：模板1μL，10μmol/L权利要求1所述的CSBV-1-F、CSBV-1-R引物和检测东方蜜蜂微孢子虫的引物各1μL，PCRMasterMix12.5μL；剩余H2O补足；（4）反应条件：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环，72℃再延伸5min，反应结束后；（5）1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶染色和观察；（6）凝胶结果判读：若出现258bp特征条带则CSBV感染阳性，有140bp的特征条带，则东方蜜蜂微孢子虫感染阳性；若无对应条带，则为阴性。3.根据权利要求2所述的一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法，其特征在于：所述的检测东方蜜蜂微孢子虫的引物为Nc-F：GAGAGAACGGTTTTTTGTTTGAGA，Nc-R：ATCCTTTCCTTCCTACACTGATTG。4.如权利要求1所述的引物在制备检测中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫试剂中的应用。2CN106282418A说明书1/3页一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法技术领域[0001]本发明属于蜜蜂病害检测领域，具体涉及一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法。背景技术[0002]中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫是东方蜜蜂的重要病害，分别由（Chinesesacbroodvirus,CSBV）和和东方蜜蜂微孢子虫（Nosemaceranae，Nc）引起，两种病原分布广泛，治愈难，主要以预防为主。因此，早期病害的快速和准确的诊断尤为重要，即有利于及时采取措施进行阻断病害传播，又可为选种、育种工作提供帮助。以往，两种病原检测是分开进行的，CSBV作为RNA病毒，必须先抽提RNA，反转录后，再用PCR检验（二步法），或直接用RT-PCR方法检测（一步法）。而Nc的感染检测最常用的方法则是，提取中肠组织，用显微镜检查确定，该法检测灵敏度低；亦有用提取Nc的DNA后，再用PCR检测的。但未见同时检测这两种病原的方法。因此，我们建立了高灵敏度的二重PCR检测方法，通过提取中肠组织RNA通过PCR同时检测两种病原，具有试剂用量少，且具有高灵敏度和高准确性的优点。该方法同时检测CSBV和Nc的灵敏度可分别低至6与3个拷贝。发明内容[0003]本发明的目的在于提供一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法，通过提取中肠组织RNA通过PCR同时检测两种病原，具有试剂用量少，且具有高灵敏度和高准确性的优点。[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测引物，所述检测中蜂囊状幼虫病引物为：CSBV-1-F：TATTCAGGGGGACGCTACAC，CSBV-1-R：GCGTGAGTTGACA