检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105671205A(43)申请公布日2016.06.15(21)申请号201610147484.1(22)申请日2016.03.15(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人刘彦杰黄家兴孙成张红丁桂玲安建东(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表1页附图3页(54)发明名称检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒(57)摘要本发明提供了一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，所述引物组包含4条引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-4所示，本发明还建立了针对CSBV的RT-LAMP试剂盒，通过对RT-LAMP条件优化，寻找到了合适的中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-LAMP检测条件，该试剂盒具有仪器要求简单、操作简便、高敏感度、高特异性、成本低廉、直接观察结果等特点，尤其适合基层技术人员检测使用，对CSBV真正做到早检测，早预防，确保我国中华蜜蜂蜂群的健康发展，保证区域内野生植物和农作物正常授粉，维持生态平衡。CN105671205ACN105671205A权利要求书1/2页1.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于，包含以下四条引物：F3：5’-GGAGGAAAGAATTACGCATTG-3’；B3：5’-TCGAATACTCATTCCAACGAT-3’；FIP：5’-GTAACCATCAGGTGGAAAACTATCTAAAGCAATCAACTTATTGGCC-3’；BIP：5’-CCAGTTAAGCCGACAAATAGCAATATAGATACATTCGCGGGCA-3’。2.一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的RT-LAMP引物组进行RT-LAMP扩增反应。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，检测反应条件为：60-65℃下反应55-65min，80℃作用5-10min结束反应。4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每25μL的RT-LAMP检测体系包括：6.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RT-LAMP引物组。2CN105671205A权利要求书2/2页7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒中还包括RT-LAMP反应所需试剂。8.权利要求1所述的RT-LAMP引物组或权利要求6-7中任意一项所述的试剂盒在制备检测或诊断中华蜜蜂囊状幼虫病毒的制剂中的用途。3CN105671205A说明书1/6页检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒技术领域[0001]本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的RT-LAMP引物组及试剂盒。背景技术[0002]蜜蜂囊状幼虫病是一种严重危害幼虫的病毒性疾病，由蜜蜂囊状幼虫病毒(SacbroodVirus，SBV)引起。蜜蜂囊状幼虫病毒属于小RNA病毒，目前至少可以感染蜜蜂科的两大蜂种即西方蜜蜂和东方蜜蜂，能感染中华蜜蜂的病毒被称为中华蜜蜂囊状幼虫病毒(ChineseSacbroodVirus，CSBV)。此病毒对蜂群危害极其严重，尤其对我国本土蜂种中华蜜蜂危害极其严重；中华蜜蜂为东方蜜蜂一个亚种，对此病毒抵抗力非常弱，极易暴发流行。自从1972年中华蜜蜂囊状幼虫病首次在中国广东爆发至今，此病毒对中华蜜蜂蜂群发展及生产能力造成了严重的影响，导致我国中华蜜蜂的种群数量急剧减少。流行病学调查结果显示，此病目前已成为危害中华蜜蜂种群发展最严重的常发疾病之一。在一些地区，中华蜜蜂囊状幼虫病的发病率高达100％，甚至有些蜂场直接导致蜂群崩溃，当地众多野生植物和农作物的传粉受到了严重的影响，生态环境平衡以及作物收成面临严峻的考验。[0003]中华蜜蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的传播大体可以归纳为群内传播、群间传播、蜂场间传播和地区间传播四个途径。开发有效的病毒早期检测技术，做到早发现、早预防、早控制就显得尤为重要。目前生产实践中主要通过观察症状和聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)方法等检测CSBV，但是当蜂群出现明显症状时通常就错过了最佳防控时期，具有明显滞后性；一般PCR检测条件要求苛刻，且价格昂贵，不利于基层使用和推广。病毒的早期检测技术对于病害的防控意义重大，因此建