检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112779341A(43)申请公布日2021.05.11(21)申请号202110212998.1(22)申请日2021.02.25(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人徐书法于慧敏李南南武江利王秀红吴鹏杰李薇(74)专利代理机构北京惟诚致远知识产权代理事务所(普通合伙)11536代理人王慧凤李巍(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表2页附图6页(54)发明名称检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒(57)摘要本发明公开了检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒。本发明检测中华蜜蜂囊状幼虫病的探针，其核苷酸序列为序列表中序列1。检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组的试剂盒，包括所述的探针和核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对。本发明可以快速有效地对中华蜜蜂囊状幼虫病进行诊断，通过快速诊断可以有效控制疾病的传播和蔓延，可以取得较大的经济效益；也将为今后研究病毒感染量与发病情况之间的关系提供方法；为预测囊状幼虫病的发生与发展提供依据；亦对蜂业生产过程中保障蜂产品安全做出贡献。CN112779341ACN112779341A权利要求书1/1页1.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病的探针，其核苷酸序列为序列表中序列1。2.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组的试剂盒，包括权利要求1所述的探针和核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对。3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括2×TaqPCRMastermix。4.一种检测中华蜜蜂囊状幼虫病的PCR扩增体系溶液，包括2×PremixExTaq10μL、序列表中序列2的DNA片段4pmol、序列表中序列3的DNA片段4pmol、序列表中序列1所示的DNA片段6pmol。5.根据权利要求4所述的PCR扩增体系溶液，其特征在于，所述PCR扩增体系溶液为20μL,余量为无RNase水。6.权利要求1所述的检测中华蜜蜂囊状幼虫病的探针在制备检测中华蜜蜂囊状幼虫病的试剂盒中的应用。2CN112779341A说明书1/6页检测中华蜜蜂囊状幼虫病的引物组、探针及试剂盒技术领域[0001]本发明涉及了中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断方法和实验室诊断方法。适用于中华蜜蜂囊状幼虫病的临床诊断、实验室检疫鉴定和流行病学调查。背景技术[0002]蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病毒引起的一种蜜蜂幼虫传染病。病死的蜜蜂幼虫呈囊状，囊中充满粒状水液。成年蜂受感染无明显症状，常能自愈。[0003]美国学者White最早分别于1913和1917年提出囊状幼虫病是由滤过性病毒引起的。英国Bailey等于1964年观察到囊状幼虫病病毒粒子形态，该粒子具有传染性，定名为囊状幼虫病毒(Sacbroodbeevirus，简称SBV)。在分类学上，该病原属于小核糖核酸病毒目(Picornavirales)，传染性软化病毒科(Iflaviridae)，传染性软化病毒属(Iflavirus)。病毒粒子无囊膜，为直径28‑30纳米的正二十面体病毒粒子，沉降系数为160S，浮密度(CsCl)为1.35g/mL(pH7.0‑9.0，<4.0时不稳定)。病毒粒子的三维结构已解析，最外面是衣壳，由三种结构蛋白VP1、VP2和VP3组成，中间是由VP4组成的无定形膜状物，与衣壳松散连接，最里面是病毒核酸。病毒基因组为正义单链RNA，长度约为8800bp。基因组编码一个大的多聚蛋白，其中3种结构蛋白位于其近5’端，非结构蛋白(解旋酶、蛋白酶和复制酶)位于其近3’端。多聚蛋白经体内加工会被切割成上述有功能的蛋白。基因组的两侧各存在一个非翻译区(UTRs)，5’末端与VPg蛋白共价连接，3’末端连有一个Poly(A)尾。[0004]中华蜜蜂囊状幼虫病是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒引起的一种中华蜜蜂幼虫传染病。[0005]1971年冬，广东省佛冈、从化、增城等地首先发生了中蜂囊状幼虫病毒病，次年全省流行，很快迅速蔓延到福建、江苏、江西、浙江、安徽、湖南、四川、青海、贵州等省，至2019年，已蔓延至全国的中蜂饲养区。病害在新区暴发时，传染速度极快，危害性很大，可造成30％‑90％的蜂群损失。老病区病害虽已趋向平稳，但某些年份也会突然重新短暂的流行。近几年又有新的变异毒株出现，对中蜂饲养威胁很大。在印度、泰国和尼泊尔等国的东方蜜蜂中也发现了此病的蔓延。[0006]中华蜜蜂囊状幼虫病毒病的病原是中华蜜蜂囊状