中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号CN106872697B(45)授权公告日2018.05.15(21)申请号201710073299.7(56)对比文件(22)申请日2017.02.10CN102504023A,2012.06.20,全文.KR10-2013-0071028A,2013.06.28,全文.(65)同一申请的已公布的文献号CN103760344A,2014.04.30,全文.申请公布号CN106872697ACN105671205A,2016.06.15,全文.(43)申请公布日2017.06.20WO2015/077522A1,2015.05.28,全文.(73)专利权人江西农业大学youli等.PHYLOGENEICANALYSISOFTHE地址330045江西省南昌市经济开发区志HONEYBEESACBROODVIRUS.《JOURNALOF敏大道1101号APICULTURALSCIENCE》.2016,第60卷(第1期),第31-38页.(72)发明人王子龙李游曾志将吴小波颜伟玉谢国秀刘俊峰审查员陈伟潘(74)专利代理机构江西省专利事务所36100代理人黄新平(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条(57)摘要本发明公开一种快速检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的免疫胶体金试纸条，包括PVC底板，PVC底板上从左至右依次固定样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，硝酸纤维素膜上设有相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫标记有一种鼠抗中囊病病毒衣壳蛋白vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被另一种鼠抗vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的质控线包被羊抗鼠IgG。该胶体金试纸条用于检测中华蜜蜂囊状幼虫病病毒，试纸条检测的特异性强，操作简便、快速，结果直观，便于推广应用。CN106872697BCN106872697B权利要求书1/1页1.一种中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条，其特征在于：它包括PVC底板，PVC底板上从左至右依次固定样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，硝酸纤维素膜上设有相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫标记有一种鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒衣壳蛋白vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测线包被另一种鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒vp3单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的质控线包被羊抗鼠IgG。2.根据权利要求1所述中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）首先对中华蜜蜂囊状幼虫病病毒衣壳蛋白vp3基因进行克隆、蛋白表达及纯化，获得外源vp3蛋白；（2）制备鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒vp3单克隆抗体：以纯化的vp3蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，筛选获得两个不同的杂交瘤细胞株，利用这两个细胞株制备两种不同的单克隆抗体；（3）制备中华蜜蜂囊状幼虫病病毒免疫胶体金检测试纸条：a、标记vp3单克隆抗体的胶体金垫制备：采用柠檬酸三钠作为还原剂来制备胶体金，对上述步骤（2）中制备的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒vp3单克隆抗体中的一种进行胶体金标记，先确定单抗与胶体金结合的标记浓度和pH值；随后将单克隆抗体在搅拌状态下加入胶体金，边加边搅拌后，室温放置；再加入牛血清白蛋白，搅拌均匀，离心；去除沉淀取上清后，再离心；沉淀用1/10原体积的金标保存液重悬，所述金标保存液含1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween-20的磷酸缓冲盐溶液，将制备的胶体金标记抗体铺在玻璃纤维膜上，室温干燥后，制成胶体金垫；b、试纸条组装：将另一种鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒vp3单克隆抗体划线于硝酸纤维素膜作为检测线，距离检测线5mm处以羊抗鼠IgG抗体划线作为质控线；将PVC底板的粘面暴露，将硝酸纤维素膜粘在中间位置，接着粘贴金标垫并使其压在硝酸纤维素膜前端0.2cm处，然后以聚酯纤维膜为样品垫，粘贴样品垫压在金标垫的另一端，最后粘贴吸水垫。3.根据权利要求2所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（3）的（a）中所述鼠抗中华蜜蜂囊状幼虫病病毒vp3单克隆抗体与胶体金结合的标记浓度是38μg/ml-60μg/ml，最佳标记浓度为50.4μg/ml，结合的最适pH值为8.0。4.根据权利要求2所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，其中步骤（3）的（a）中制备的胶体金粒径为15-40nm；室温放置20min，加入的牛血清白蛋白的浓度为10%，牛血清白蛋白在溶液中的终浓度为1%，胶体金标记抗体按1ml涂15cm2的比例涂在玻璃纤维膜上。5.根据权利要求2所述的中华蜜蜂囊状幼虫病病毒的免疫胶体金试纸条的制备