中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测引物和探针及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112011650A(43)申请公布日2020.12.01(21)申请号202011203754.9(22)申请日2020.11.02(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人侯春生杨卅袁春颖邓炎春赵红霞(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人黄爽(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6844(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图1页(54)发明名称中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测引物和探针及试剂盒(57)摘要本发明提供一种中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT‑RPA检测引物和探针及试剂盒。本发明还提供一种方便快捷、特异性高的中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT‑RPA检测方法，所述RT‑RPA检测引物和探针的序列分别如SEQIDNO:1‑3所示。本方法能满足现场应急对中华蜜蜂囊状幼虫病毒快速诊断的需求。CN112011650ACN112011650A权利要求书1/1页1.中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测引物和探针，其特征在于，上、下游引物和探针序列分别如下：上游引物：5’-ATCACCTAGTGGAGCGCCCATCACCGTAGT-3’下游引物：5’-CATTATCAAATCATCACCGTAGCAGAACAA-3’探针：5’-ATATTTTATATGTTTTTGTAGCTTGGGAGA[FAM-dT]GC[THF]AG[BHQ-dT]AGGAAGTAAAGAA[C3-spacer]-3’。2.含有权利要求1所述引物和探针的检测试剂或试剂盒。3.中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物和探针，还含有反转录酶、结合单链核酸的DNA重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、磷酸激酶、ATP、标准阳性模板、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、RNA酶抑制剂、酶扩增八联管。4.非诊断目的RT-RPA检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提取待测样本总RNA；2）配制含有权利要求1所述引物和探针的RT-RPA反应体系，向反应体系中加入上述提取的总RNA，进行RT-RPA扩增；3）分析扩增产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述RT-RPA反应体系包括：再水化缓冲液12.5ul20umol/L上游引物2ul20umol/L下游引物2ul10umol/L探针0.6ulRNA模板1ulddH2O29.4ul280mM醋酸镁溶液2.5ul。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RT-RPA扩增条件为：37-42℃，20-30min。7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤3）包括：根据是否出现扩增曲线，分析待测样本中是否含有中华蜜蜂囊状幼虫病毒；如果有相应的扩增曲线表示待测样本含有中华蜜蜂囊状幼虫病毒，结果为阳性；如果没有扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到中华蜜蜂囊状幼虫病毒，结果为阴性。2CN112011650A说明书1/5页中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测引物和探针及试剂盒技术领域[0001]本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及中华蜜蜂囊状幼虫病毒RT-RPA检测引物和探针及试剂盒。背景技术[0002]中华蜜蜂是我国特有的蜂种，在我国的农业作物开花授粉及野生植物的多样性具有重要的生态意义。但是自上个世纪70年代以来，中华蜜蜂一直受到中华蜜蜂囊状幼虫病毒病的威胁，给中华蜜蜂的健康发展带来严重的阻碍。中华蜜蜂囊状幼虫病，是由中华蜜蜂囊状幼虫病毒（ChineseSacbroodVirus，CSBV）引起的一种高致病性、高传染性的病毒性疾病，俗称为“烂子病”，可以造成蜜蜂幼虫的大量死亡。CSBV属于小RNA病毒科，基因组由长约8.8kb的单股正链RNA分子组成，整个基因组有一个大的开放阅读框（ORF）。CSBV编码四种结构蛋白（VP1~VP4）。中华蜜蜂囊状幼虫病毒的传播分为水平和垂直传播，其水平传播更为广泛，大体可以归纳为群内传播、群间传播、蜂场间传播和地区间传播四个途径。更为严重的是，在发现有典型症状时，蜂群已感染非常严重，一般采取毁巢或焚烧的手段阻止病毒的传播，给蜂农带来巨大经济损失，并严重影响到农作物的开花授粉。开发有效的病毒早期检测与诊断技术，做到早发现、早预防、早控制显得尤为重要。[0003]对CSBV的早期、快速和有效检测是预防和控制疫情传播的重要手段之一，目前，已经建立了多种CSBV检测方法，主要包括病毒分离鉴定、间接免疫荧光方法、免疫电镜法和ELISA等传统方法，但这些传