蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106755494A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201710057646.7(22)申请日2017.01.26(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银郑腾李丹丹白泉阳王武军张志灯于师宇(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图3页(54)发明名称蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法(57)摘要本发明涉及蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜂房蜜蜂球菌的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌水。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜂房蜜蜂球菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到50拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明试剂盒可用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断及其蜂房蜜蜂球菌的检测，对该病的早期预防和及时治疗具有重要意义。CN106755494ACN106755494A权利要求书1/1页1.一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物F、反向引物R及TaqMan探针P，各引物核苷酸序列如下：正向引物F：5’-AACGCTTCTTCTGATTAAG-3’，反向引物R：5’-GCCTTTTAACTCCTCTTC-3’；TaqMan探针P：5’-ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。2.根据权利要求1所述的一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：（1）阳性标准品：100μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（2）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜂房蜜蜂球菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR缓冲液625μL，浓度为10μmol/L的正向引物F和反向引物R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，共计850μL；-20℃保存；（4）ExTaq酶：25μL浓度为5U/μLExTaq酶1支，-20℃保存；（5）无菌水：2mL无菌水2支。3.利用权利要求1或2所述的蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0μL，5U/μLExTaq酶0.5μL，待测样品DNA2.0μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；（2）PCR反应程序：95℃预变性3min；然后95℃变性5s、59℃退火延伸30s，共40个循环，在59℃进行单点荧光检测；（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜂房蜜蜂球菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜂房蜜蜂球菌。2CN106755494A说明书1/4页蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物卫生技术领域，适用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断和监测及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌的检测。背景技术[0002]欧洲幼虫腐臭病（Europeanfoulbrood，简称EFB）是由蜂房蜜蜂球菌引起的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，能导致蜜蜂幼虫的大批死亡，最终导致整个蜂群的灭亡，危害巨大。该病是一种消化道传染病，主要侵害1~2日龄的蜜蜂幼虫，经2~3天潜伏期，多在3~4日龄未封盖时死亡。[0003]EFB在世界各地均有发生，其中中蜂发病比意蜂更严重，我国也是主要的疫区之一。该病具有传播迅速、发病快的特点，是蜜蜂的主要病害。农业部和质检总局