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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107190081A(43)申请公布日2017.09.22(21)申请号201710563000.6(74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所(22)申请日2017.07.11(普通合伙)11491代理人黄耀钧(71)申请人伊犁职业技术学院地址835000新疆维吾尔自治区伊宁市胜(51)Int.Cl.利街179号C12Q1/68(2006.01)申请人新疆出入境检验检疫局检验检疫技C12Q1/04(2006.01)术中心C12R1/01(2006.01)伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心(72)发明人何晓杰王科珂苏娃王振宝叶尔保勒艾山江·塔斯坦皮志媛陈霞李胜阿斯喀·夏热甫汉叶尔兰·阿不都买金哈森权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页(54)发明名称蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法(57)摘要本发明属于蜂房蜜蜂球菌检测技术领域,公开了一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据M.pluton16SrRNA基因序列设计了特异性引物和探针,建立蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,从标准品浓度1.0×108拷贝/μL~1.0×102拷贝/μL呈良好的线性关系,扩增效率可达0.999;与P.larvae、N.apis、A.apis等蜜蜂常见疫病病原无交叉反应;敏感性试验结果显示,可检出最低1.0×10拷贝/μL的目的基因,与普通PCR相比,灵敏度提高了1000倍;批内、批间实验表明有着较好的重复性;样品检测结果表明该方法具有广泛的适用性。CN107190081ACN107190081A权利要求书1/1页1.一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,其特征在于,所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤:步骤一,将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增,获得大小为157bp的目的片段,PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对,与GenBank中登录序列同源性达到100%;将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm=1.92,计算其浓度为1.0×108拷贝/μL;步骤二,应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为:10×PCRbuffer2.5μL,MgCl21.5μL,dNTPs2μL,上下游引物各1μL,特异性探针0.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板DNA1μL,加灭菌ddH2O至25μL;优化后的反应条件为:92℃3min;92℃10s、60℃30s,40个循环,60℃时收集荧光信号。2.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,其特征在于,所述F/R上下游引物的序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。3.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,其特征在于,所述探针的序列为SEQIDNO:3。4.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,其特征在于,所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤:DNA抽提:采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA;对照设置:蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照,同时设立无模板空白对照;PCR反应体系配置:在PCR管中加入10×PCRbuffer2.5μL,MgCl21.5μL,dNTPs2.0μL,上下游引物各1.0μL,特异性探针0.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,模板DNA1.0μL,加灭菌ddH2O15.0μL,使反应总体积为25.0μL;PCR反应程序:92℃预变性3min;92℃变性10s、60℃退火延伸30s,共40个循环,在60℃时收集荧光信号;结果判定:阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线,阳性对照的Ct值应≤36,并且出现典型的扩增曲线,说明试验为有效试验,否则试验无效;在试验有效的情况下,待测样品无Ct值,并且无扩增曲线,表示样品中无蜂房蜜蜂球菌;待测样品Ct值≤36,并且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌;待测样品Ct值>36的样品重复检测,重复检测结果无Ct值表示样品中无蜂房蜜蜂球菌,重复检测结果有Ct值表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌。2CN107190081A说明书1/6页蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法技术领域[0001]本发明属于蜂房蜜蜂球菌检测技术领域,尤其涉及一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。背景技术[0002]欧洲幼虫腐臭病(European