蜜蜂幼虫芽孢杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107012251A(43)申请公布日2017.08.04(21)申请号201710354486.2(22)申请日2017.05.19(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银郑腾白泉阳王武军李丹丹张志灯于师宇(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12R1/07(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图3页(54)发明名称蜜蜂幼虫芽孢杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用(57)摘要本发明涉及蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌水。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到20拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明试剂盒可用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病的诊断及其蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测，对该病的早期预防和及时治疗具有重要意义。CN107012251ACN107012251A权利要求书1/1页1.一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物PL-F、反向引物PL-R及TaqMan探针FL-P，各引物核苷酸序列如下：正向引物PL-F：5’-TTCGGGAGACGCCAGGTTAG-3’，反向引物PL-R：5’-AGCCGTTACCCTACCAACTAGC-3’；TaqMan探针FL-P：5’-TCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCA-3’，探针的5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。2.根据权利要求1所述的一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：（1）阳性标准品：100μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；（2）阴性对照：100μL浓度为100ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜜蜂幼虫芽孢杆菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR缓冲液625μL，浓度为10μmol/L的正向引物PL-F和反向引物PL-R各25μL，浓度为5μmol/L的TaqMan探针FL-P50μL，浓度为10mmol/L的dNTP25μL，浓度为25mmol/L的MgCl2100μL，共计850μL；-20℃保存；（4）ExTaq酶：25μL浓度为5U/μLExTaq酶1支，-20℃保存；（5）无菌水：2mL无菌水2支。3.利用权利要求1或2所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0μL，5U/μLExTaq酶0.5μL，待测样品DNA2.0μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；（2）PCR反应程序：95℃预变性2min；然后95℃变性5s、64℃退火延伸30s，共40个循环，在64℃进行单点荧光检测；（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌。2CN107012251A说明书1/4页蜜蜂幼虫芽孢杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物卫生技术领域，适用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病的诊断和监测及蜂产品中蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测。背景技术[0002]美洲幼虫腐臭病（Americanfoulbrood，AFB）简称美腐病，是侵害蜜蜂幼虫的一种细菌性疾病。该病主要危害意蜂，在世界范围内均有发生，一旦暴发，会带来严重的经济损失。美腐病是我国从日本引进西方蜜蜂时带来的，在我国饲养的意蜂中经常发生，目前已在我国的十几个省市的蜂群中发现该病。被