一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109825618A(43)申请公布日2019.05.31(21)申请号201910258230.0C12R1/07(2006.01)(22)申请日2019.04.01C12R1/01(2006.01)(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人黄嫦娇张体银邵碧英陈彬(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊饶文君(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图3页(54)发明名称一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法(57)摘要本发明提供一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法，用于蜜蜂及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测。本发明方法对蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测具有高度特异性，相互之间及与其它蜜蜂致病菌无交叉反应，且重复性好；检测两种致病菌的灵敏度均能达到约1pg/μL；整个操作不需要昂贵的仪器和试剂，一次操作可以同时检测两种病原，全部反应在2个小时内完成。本发明为蜜蜂及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的快速检测提供了新的技术手段，对于保护国内蜂群的健康安全和促进蜂产品国际贸易的健康发展具有重要的现实意义和实际应用价值。CN109825618ACN109825618A权利要求书1/1页1.一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR引物，其特征在于：包括用于扩增蜂房蜜蜂球菌特异片段的上游引物MP-F、下游引物MP-R和扩增蜜蜂幼虫芽孢杆菌特异片段的上游引物PL-F、下游引物PL-R，各引物核苷酸序列如下：上游引物MP-F：5’-AGAAGAGTGGCGGACGGGTGA-3’；下游引物MP-R：5’-ACCGTCACGAGGAAAACAGTTACTC-3’；上游引物PL-F：5’-GCCAAGGAAGAACGGCCAGGG-3’；下游引物PL-R：5’-CCACCTCTGCGTGCTGGCAA-3’。2.一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）双重PCR反应体系配置：2×PCRMasterMix12.5μL，10μmol/L权利要求1所述的上下游引物MP-F和MP-R各0.5μL，10μmol/L权利要求1所述的上下游引物PL-F和PL-R各0.75μL，待测样品DNA2μL，然后加入去离子水8.0μL，使反应总体积为25.0μL；（2）双重PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性45s，64℃退火30s，72℃变性45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保温；（3）PCR扩增产物检测分析与判定：取8μLPCR扩增产物，在加入0.01%GelRed核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶上电泳后，在凝胶成像系统上检测PCR扩增产物后进行结果判定：当所述双重PCR扩增产物中含有大小为401bp的条带，则所述待测样品含有蜂房蜜蜂球菌；当所述双重PCR扩增产物中含有大小为706bp的条带，则所述待测样品含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；当所述双重PCR扩增产物中同时含有大小为401bp的条带和706bp的条带，则所述待测样品同时含有蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌。2CN109825618A说明书1/5页一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种检测蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌的双重PCR检测方法，属于生物技术领域，适用于蜜蜂及蜂产品中蜂房蜜蜂球菌和蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测。背景技术[0002]蜜蜂美洲幼虫腐臭病（Americanfoulbrood，AFB）和欧洲幼虫腐臭病（Europeanfoulbrood，EFB）是两种能引起蜜蜂幼虫死亡的细菌性、急性、毁灭性传染病，能导致蜜蜂幼虫的大批死亡，最终导致整个蜂群的灭亡，危害巨大。农业部和质检总局联合制定的最新的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》将二者列为二类传染病。世界动物卫生组织（OIE）也将其列入检疫名录，列为进出口蜜蜂及蜂产品检疫对象。[0003]美洲幼虫腐臭病是目前危害蜜蜂幼虫生长的最主要细菌病之一，轻者降低蜂群繁殖和采集力，重者导致蜂群的覆灭。该病传播迅速、为害严重，发生后就很难治愈，难以根除，而且经常复发，尤其是1日龄的蜜蜂幼虫对幼虫芽孢杆菌非常敏感，一旦感染很快就会死亡。[0004]欧洲幼虫腐臭病是一种蜜蜂幼虫的恶性传染病，传播快、危害大，可引起幼虫大批死亡。患病蜂群不能正常采蜜