蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107130055A(43)申请公布日2017.09.05(21)申请号201710562143.5(51)Int.Cl.(22)申请日2017.07.11C12Q1/68(2006.01)C12Q1/06(2006.01)(71)申请人伊犁职业技术学院地址835000新疆维吾尔自治区伊宁市胜利街179号申请人伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心(72)发明人何晓杰巴音查汗·盖力克艾山江·塔斯坦王振宝叶尔保勒苏娃皮志媛陈霞李胜叶尔兰·阿不都买金阿斯喀·夏热甫汉哈森(74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所(普通合伙)11491代理人黄耀钧权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页(54)发明名称蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法(57)摘要本发明属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测技术领域，公开了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，根据P.larvae16SrRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，弥补了现有技术的不足。本发明建立的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，批内和批间重复性试验Ct值变异系数均小于3％；适用范围广，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。因此，可用于蜜蜂及蜂产品中AFB的早期、高通量快速诊断及P.larvae定量分析。CN107130055ACN107130055A权利要求书1/1页1.一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae16SrRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。2.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。3.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为：SEQIDNO：3。4.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法检测流程为：DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCRbuffer2.5μL，MgCl21.5μL，dNTPs2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O15.0μL，使反应总体积为25.0μL；PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。2CN107130055A说明书1/6页蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法技术领域[0001]本发明属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测技术领域，尤其涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。背景技术[0002]美洲幼虫腐臭病(Americanfoulbrood，AFB)是由幼虫芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae，P.larvae)引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，其典型症状为封盖后死亡的幼虫巢房盖变潮湿、下陷、颜色发暗并显油光，大部分巢房盖穿孔，挑取虫体可拉出长10cm～15cm的胶体状细丝，患病幼虫虫体变软，失去正常白色和光泽，逐渐变成淡褐色至棕黑色。这种芽孢杆菌有7层结构包围，特殊的结构使其极具生命力，在恶劣环境下仍可存活35年以上。AFB一旦在蜂场发生，极易造成幼虫死亡和蜂群群势衰弱，且很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。目前，AFB主要根据临床症