一种ddPCR检测包虫病的扩增引物及其构建方法、应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113637774A(43)申请公布日2021.11.12(21)申请号202110962259.4(22)申请日2021.08.20(71)申请人四川大学华西医院地址610000四川省成都市武侯区国学巷37号(72)发明人曾勇袁克非廖明恒杨耀玲徐琳冯旭萍(74)专利代理机构成都云纵知识产权代理事务所(普通合伙)51316代理人刘沙粒伍星(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表1页附图2页(54)发明名称一种ddPCR检测包虫病的扩增引物及其构建方法、应用(57)摘要ddPCR检测肝包虫病的引物构建方法、扩增引物及其应用，该方法包括以下步骤：筛选细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段，基于共同基因片段设计多个第一引物；采用第一引物扩增第一病患组的血浆cfDNA样本，将能够扩增第一病患组的血浆cfDNA样本的第一引物作为第二引物；采用反应体系包括第二引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第二引物作为目标扩增引物。本发明得到的扩增引物能够扩增释放进入外周血液中的以血浆游离DNA的形式存在的棘球绦虫的DNA片段，结合ddPCR方法能够通过检测人体血浆诊断是否感染包虫病，实现了细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的超早期诊断，为研发包虫病精准疗法提供了足够灵敏的检测工具。CN113637774ACN113637774A权利要求书1/2页1.一种ddPCR检测包虫病的扩增引物的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(A)筛选细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同基因片段，基于所述共同基因片段设计多个第一引物；(B)采用所述第一引物扩增第一病患组的血浆cfDNA样本，将能够扩增第一病患组的血浆cfDNA样本的第一引物作为第二引物；(C)采用反应体系包括第二引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第二引物作为ddPCR检测包虫病的扩增引物。2.根据权利要求1所述的一种ddPCR检测包虫病的扩增引物的构建方法，其特征在于，所述步骤(A)包括以下步骤：(A1)获取基因组数据，获取细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、近亲缘关系绦虫组、以及人类的基因组数据；(A2)排除人类基因影响，细粒棘球绦虫的基因组、多房棘球绦虫的基因组分别与人类基因组比对，排除细粒棘球绦虫的基因组中与人类基因组相同的基因片段，得到第一细粒棘球绦虫基因片段；排除多房棘球绦虫的基因组中与人类基因组相同的基因片段，得到第一多房棘球绦虫基因片段；(A3)排除近亲缘关系绦虫基因影响，第一细粒棘球绦虫基因片段、第一多房棘球绦虫基因片段分别与近亲缘关系绦虫组的基因组比对，排除第一细粒棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，得到第二细粒棘球绦虫基因片段，排除第一多房棘球绦虫基因片段中与近亲缘关系绦虫组的基因组相同的基因片段，得到第二多房棘球绦虫基因片段；(A4)筛选共同基因片段，比对第二细粒棘球绦虫基因片段和第二多房棘球绦虫基因片段，筛选出相同的基因片段作为所述共同基因片段。3.根据权利要求1所述的一种ddPCR检测包虫病的扩增引物的构建方法，其特征在于，筛选能够扩增第一病患组中多个不同的血浆cfDNA样本的第二引物作为第三引物，并采用反应体系包括第三引物的ddPCR检测第二病患组的血浆cfDNA样本，筛选出阳性检出率大于预设值的第三引物作为ddPCR检测包虫病的扩增引物。4.基于权利要求1～3中任一项所述的构建方法得到的用于ddPCR检测包虫病的扩增引物。5.根据权利要求4所述的扩增引物在制备包虫病的检测试剂中的应用。6.根据权利要求4所述的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括第五引物对和第六引物对，其中，所述第五引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第六引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。7.根据权利要求6所述的扩增引物在ddPCR检测包虫病中的应用，其特征在于，若所述第五引物对或所述第六引物对的血浆样本检测结果为阳性，则所述血浆样本的检测结果为阳性。8.根据权利要求6或7所述的扩增引物在ddPCR检测包虫病中的应用，其特征在于，采用所述第五引物对的ddPCR的拷贝数分界线为0.23，当血浆样本中拷贝数大于0.23时检测结果为阳性，血浆样本中拷贝数小于或等于0.23时检测结果为阴性；采用所述第六引物对的ddPCR的拷贝数分界线为0.16，当血浆样本中拷贝数大于0.16时检测结果为阳性，血浆样本2CN113637774A权利要求书2/2页中拷贝数小于或等于