一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106939356A(43)申请公布日2017.07.11(21)申请号201710278715.7(22)申请日2017.04.25(71)申请人广东省生物资源应用研究所地址510260广东省广州市海珠区新港西路105号(72)发明人张祎韩日畴(74)专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001代理人刘明星(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页(54)发明名称一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法(57)摘要本发明公开了一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明针对蜜蜂丝状病毒ATPase特异性靶基因设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增的检测方法，进而确定待检测样品中是否存在蜜蜂丝状病毒的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确率好、检测时间短的优点，从样品处理到报告结果只需花4h，不需要PCR仪和电泳仪，操作过程简单，比其他PCR技术具有更高的特异性。特别适合蜜蜂病原调查与疾病防控使用。CN106939356ACN106939356A权利要求书1/1页1.一种利用环介导等温扩增检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：上游外引物F3：5’-TGGATCGTCGGGATCGTC-3’；下游外引物B3：5’-AACTCGGGAAACAGTGGC-3’；上游内引物FIP：5’-GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT-3’；下游内引物BIP：5’-GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC-3’。2.一种非疾病的诊断和治疗目的的蜜蜂丝状病毒的检测方法，其特征在于，提取样品总DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对样品DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为蜜蜂或蜂产品。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对样品DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL10mMdNTPs、0.5μL10μM上游外引物F3、0.5μL10μM下游外引物B3、1μL40μM上游内引物FIP、1μL40μM下游内引物BIP、0.6μL100mMMgSO4、12.5μL2M甜菜碱、4μL灭菌双蒸水，1μL8U/μLBstDNA聚合酶和1μL样品DNA模板，反应条件为在温度为60℃～65℃孵育45～60min。5.一种蜜蜂丝状病毒的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：上游外引物F3：5’-TGGATCGTCGGGATCGTC-3’；下游外引物B3：5’-AACTCGGGAAACAGTGGC-3’；上游内引物FIP：5’-GTGACTCAAACAGACTCGCGGTCTGCTTCATCTGAACCGTCT-3’；下游内引物BIP：5’-GCGGGACCTCCTATTTCGCTGGTCAACTTGGCCCGTAACC-3’。2CN106939356A说明书1/5页一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法技术领域：[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及一种快速检测蜜蜂丝状病毒的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。背景技术：[0002]意大利蜜蜂丝状病毒AmFV(ApismelliferaFilamentousVirus，AmFV)是其中唯一的一种dsDNA病毒，其基因组达498500bp，基因组DNA和核蛋白经折叠和环化，形成长450×170nm的杆状，根据基因组分析类似于无脊椎动物的杆状病毒。具有较广的宿主谱，包括意大利蜜蜂、中华蜜蜂，以及一些独栖蜂如熊蜂。其传播方式有水平传播和垂直传播。AmFV单独感染蜜蜂不会引起明显的病理特征，与微孢子虫共感染时会致死蜜蜂，死蜂的血淋巴呈乳白色，一般会在春季发病。因此建立一种简单快速有效的检测方法，采取相应的防御措施，有助于预防疾病的发生。[0003]LAMP技术是2000年以来Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，具有检测时间短，高灵敏度和高特异性，操作简单，仅仅需要普通水浴锅就可以完成检测。近年来已广泛用于各种病原检测。其特点是针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性