一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针与应用及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112853003A(43)申请公布日2021.05.28(21)申请号202110241403.5(22)申请日2021.03.04(71)申请人福州海关技术中心地址350001福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银李丹丹王武军田国宁张志灯于师宇(74)专利代理机构北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙)11732代理人周新楣(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图3页(54)发明名称一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针与应用及其检测方法(57)摘要本发明涉及动物检疫技术领域。本发明提供了一组能够特异性检测蜜蜂急性麻痹病毒的实时荧光RT‑PCR的引物组和探针，并利用所述的引物组和探针对实时荧光RT‑PCR的反应体系和反应程序进行优化得到的非诊断目的的检测方法。本发明的检测方法具有以下优点：(1)灵敏度高：本方法检测限达到9.8拷贝/μL；(2)特异性强：对蜜蜂急性麻痹病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；(3)操作简单、快速：整个反应约50分钟即可完成；(4)本发明可用于非诊断目的的蜜蜂急性麻痹病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别，对于保障我国养蜂业和维护自然生态的健康发展具有重要意义。CN112853003ACN112853003A权利要求书1/1页1.一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针，其特征在于，包括上游引物ABPV‑F、下游引物ABPV‑R及TaqMan探针ABPV‑P；所述上游引物ABPV‑F的序列如：SEQIDNO.1所示；所述下游引物ABPV‑R的序列如：SEQIDNO.2所示；所述TaqMan探针ABPV‑P的序列如：SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的引物组和探针，其特征在于，所述TaqMan探针ABPV‑P的5'端采用荧光基团ROX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。3.一种权利要求1或2所述的引物组和探针扩增得到的目的片段，其特征在于，所述扩增得到的目的片段的大小为191bp，序列如SEQIDNO.4所示。4.一种权利要求1或2所述的引物组和探针在制备检测蜜蜂急性麻痹病毒产品方面的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测蜜蜂急性麻痹病毒产品为试剂盒。6.一种非疾病诊断目的检测蜜蜂急性麻痹病毒的方法，其特征在于，采用实时荧光RT‑PCR进行检测。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光RT‑PCR的反应体系包括如下组分和含量：2×OneStepRT‑qPCRBuffer10μL，5U/μLDNA聚合酶0.4μL，5U/μL逆转录酶0.4μL，10μmol/LABPV‑F/R各0.8μL，10μmol/LABPV‑P0.6μL，RNA模板1.0μL，RNase‑freeH2O6μL。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光RT‑PCR的反应程序为：42℃5min；95℃30s；95℃5s，63℃30s，40个循环。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述63℃为单点荧光检测。10.根据权利要求6～9任意一项所述的方法，其特征在于，所述检测结果的判定标准为：在实验有效的情况下，样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂急性麻痹病毒；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂急性麻痹病毒；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测，重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂急性麻痹病毒；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂急性麻痹病毒；所述实验有效的情况为：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验。2CN112853003A说明书1/5页一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针与应用及其检测方法技术领域[0001]本发明涉及动物检疫技术领域，尤其涉及一种检测蜜蜂急性麻痹病毒的引物组和探针与应用及其检测方法。背景技术[0002]蜜蜂急性麻痹病毒(Acutebeeparalysisvirus，ABPV)是Bailey等在进行蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronicbeeparalysisvirus，CBPV)传染性试验时发现的，当时蜜蜂感染ABPV后很快就会死亡，而感染后者则能存活数天，存在明显的区别，目前该病在世界范围内广泛流行。ABPV主要感染西方蜜蜂，不同发育阶段的蜜蜂均能感染，蜜蜂被感染后很快会出现麻痹症状，无法飞行，然后1～2天后死亡。ABPV除了能感染西方蜜蜂外，还能感染巴西蜜蜂，且感染率可达100％，另外还可以感染多个熊蜂蜂