一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112538548A(43)申请公布日2021.03.23(21)申请号202011406570.2(22)申请日2020.12.04(71)申请人福州海关技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银邵碧英黄嫦娇王武军郑腾张志灯于师宇(74)专利代理机构北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙)11732代理人周新楣(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图4页(54)发明名称一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法(57)摘要本发明涉及动物卫生技术领域。本发明提供了一组能够特异性检测蜜蜂克什米尔病毒的实时荧光RT‑PCR的引物和探针，并利用所述的引物组合探针对实时荧光RT‑PCR的反应体系和反应程序进行优化得到的非诊断目的的检测方法。本发明的检测方法具有以下优点：(1)良好的特异性和敏感性性：对蜜蜂克什米尔病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；(2)灵敏度高：灵敏度能达到约8拷贝/μL；(3)操作简单、快速，整个反应可在60分钟内完成。本发明可用于非诊断为目的的蜜蜂克什米尔病毒的检测及其与其他蜜蜂病毒病的鉴别，对于保障我国养蜂业和维护自然生态的健康发展具有重要意义。CN112538548ACN112538548A权利要求书1/1页1.一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，其特征在于，包括上游引物KBV‑F、下游引物KBV‑R及TaqMan探针KBV‑P；所述上游引物KBV‑F的序列如：SEQIDNO.1所示；所述下游引物KBV‑R的序列如：SEQIDNO.2所示；所述TaqMan探针KBV‑P的序列如：SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针，其特征在于，所述TaqMan探针KBV‑P的5'端采用荧光基团HEX进行修饰，3'端采用BHQ1进行修饰。3.一种如权利要求1或2所述的一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针扩增得到的目的片段，其特征在于，所述扩增得到的目的片段的大小为190bp，序列如SEQIDNO.4所示。4.一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，采用实时荧光RT‑PCR进行检测。5.根据权利要求4所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实时荧光RT‑PCR检测的反应体系包括如下组分和含量：10×RT‑PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，2.5mmol/LdNTPs1.5μL，10μmol/L上下游引物KBV‑F/KBV‑R各0.5μL，10μmol/L探针KBV‑P1.0μL，5U/μLDNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL，样品RNA2μL，然后加入水9.0μL，使反应总体积为20.0μL。6.根据权利要求5所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实时荧光RT‑PCR检测的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，61℃退火30s，共40个循环。7.根据权利要求6所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述61℃退火为单点荧光检测。8.根据权利要求7所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述检测结果的判定标准为：在实验有效的情况下，样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂克什米尔病毒；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测，重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂克什米尔病毒；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂克什米尔病毒。9.根据权利要求4～8任意一项所述的一种非疾病诊断目的检测蜜蜂克什米尔病毒的方法，其特征在于，所述实验有效的情况为：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验。2CN112538548A说明书1/5页一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及检测方法技术领域[0001]本发明涉及动物卫生技术领域，尤其涉及一种检测蜜蜂克什米尔病毒的引物组和探针及其检测方法。背景技术[0002]克什米尔蜜蜂病毒(Kashmirbeevirus，KBV)最初于1977年从饲喂了患病东方蜜蜂Apiscerana病毒液的西方蜜蜂体内被分离鉴定出来，因为这些东方蜜蜂来源于克什米尔地区，所以研究者就用此地名给