蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107177690A(43)申请公布日2017.09.19(21)申请号201710562144.X(74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所(22)申请日2017.07.11(普通合伙)11491代理人黄耀钧(71)申请人伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心(51)Int.Cl.地址835000新疆维吾尔自治区伊宁市上C12Q1/68(2006.01)海南路137号申请人新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心伊犁职业技术学院(72)发明人王振宝王科珂季新成何晓杰叶尔保勒叶尔兰·阿不都买金巴音查汗·盖力克李胜阿斯喀·夏热甫汉安尧汶尚爽哈森权利要求书1页说明书7页序列表1页附图3页(54)发明名称蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法(57)摘要本发明属于病原检测技术领域，公开了一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针5′端采用比较成熟的FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团。本发明的方法与其它病原无交叉反应；对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10拷贝/μL的阳性质粒；重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2％。CN107177690ACN107177690A权利要求书1/1页1.一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针5′端采用FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团；一对幼虫芽孢杆菌引物P.larvaeF/P.larvaeRSEQIDNO：1和一条探针P.larvaePSEQIDNO：2、一对蜂房蜜蜂球菌引物M.plutonF/M.plutonRSEQIDNO：3和一条探针M.plutonPSEQIDNO：4。2.如权利要求1蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法具体检测流程为：DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；对照设置：幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；25μLPCR反应体系配置：在PCR管中加入PremixExTaq12.5μL，P.larvaeF1μL，P.larvaeR1μL，P.larvaeP1μL，M.plutonF1μL，M.plutonR1μL，M.plutonP1μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O5.5μL，使反应总体积为25.0μL；PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、59℃退火延伸50s，共40个循环，退火延伸时收集荧光信号；结果判定：阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，并且无扩增曲线，阳性对照同时使用幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌DNA或混合阳性质粒，应同时有FAM和VIC荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均≤35.0，对分别只单独使用幼虫芽孢杆菌DNA或蜂房蜜蜂球菌DNA或其阳性质粒，则各管对应只出现FAM或VIC荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且Ct值都分别≤35.0，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品有FAM和VIC荧光同时被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均≤35.0，判定为阳性，表明从样品中同时检出幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌，只有FAM荧光被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，判定为阳性，表明从样品中只检出幼虫芽孢杆菌，只有VIC荧光被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，判定为阳性，表明从样品中只检出蜂房蜜蜂球菌，无FAM或VIC荧光被检出，且无扩增曲线，无Ct值，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值>35.0的样品重新检测，重新检测结果无FAM或VIC荧光被检出，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌，重新检测结果有FAM或VIC荧光被检出，判定为阳性，表明从样品中检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌。3.如权利要求2蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，重新检测需从提取DNA开始重新检测，根据各种具体情况在可选使用量的几个因素中调整优化检测过程，如增加样品取样量、减少溶解DNA的TE剂量、增加PCR反应中加入的模