牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102162007A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102162007A(43)申请公布日2011.08.24(21)申请号201010113248.0(22)申请日2010.02.23(71)申请人中国检验检疫科学研究院地址100029北京市朝阳区惠新西街241号(72)发明人林祥梅贾广乐韩雪清吴绍强刘建梅琳王彩霞王慧煜(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王朋飞(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/06(2006.01)G01N21/64(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书13页序列表1页附图7页(54)发明名称牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法(57)摘要本发明提供一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法，根据229bp对牛分枝杆菌的高度特异性，设计引物及探针，其中，上游引物为5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物为5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；探针为5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。本发明建立了可以简便快速、准确检测牛分支杆菌的荧光定量PCR检测方法，有利于区分牛分枝杆菌和其他分枝杆菌，尤其是牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的区分，对人结核病和牛结核病的防控和治疗、牛结核病的临床检测及各种疫苗的研究具有重要意义。CN10267ACCNN110216200702162008A权利要求书1/1页1.一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其中，上游引物为：5’-TGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAG-3’；下游引物为：5’-CGTTGTAGGCCACTCCAAGAG-3’；以及探针为：5’-JOE-CGCTTCTGCACGACTACGGCTTGTATGA-Eclipse-3’。2.一种含权利要求1所述引物及探针的检测试剂盒。3.一种利用权利要求1所述的引物及探针检测牛分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)目的基因的扩增以牛分枝杆菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，其中，PCR上游引物为5’-ATCGTGAATCGTCGAGTGATG-3’，下游引物为5’-ACCCAGAAGGCGAACAGA-3’，回收PCR扩增产物；2)目的基因的克隆将步骤1)的目的基因连接在PGEM-Teasy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；3)Taqman荧光定量PCR检测以阳性重组质粒DNA为模板，利用权利要求1所述引物及探针，进行Taqman荧光定量PCR检测。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中Taqman荧光定量PCR检测的退火温度为50.5℃。2CCNN110216200702162008A说明书1/13页牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法技术领域[0001]本发明涉及一种牛分枝杆菌检测方法，具体地说，涉及一种牛分枝杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法。背景技术[0002]自从1882年Kock发现结核分枝杆菌以来，分枝杆菌新菌种的发现、命名、分类及其演变都有很大的发展变化。在微生物分类学上，分枝杆菌归属于原核生物界、原壁菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌属成员均为好氧，平直或弯曲细长，革兰氏阳性杆菌。在一定情况下可产生菌丝，但这些菌丝在搅动后成为杆状或球形。[0003]1898年，Smith首次将牛分枝杆菌(M.bovis)和其它的分枝杆菌明确区分开来。牛分枝杆菌主要感染不同种属的温血动物，包括有蹄动物、有袋动物、食肉类动物、灵长类、鳍脚类动物和啮齿类动物在内的50多种哺乳动物，还包括类鹦鹉鸟、石鸽、北美洲乌鸦等20多种禽类，其中牛是最敏感的动物。[0004]在核苷酸水平上，牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比，其同源性大于99.95％，表现出共线性，没有广泛的置换、复制或倒置现象。在牛分枝杆菌基因组全序列测定之前，一般是利用基于杂交原理(高度准确的序列鉴定)方法来比较结核分枝杆菌复合群之间的基因差别，发现牛分枝杆菌基因组中存在大小为1～12.7kb不等的片段缺失。在牛分枝杆菌中，仅有一个被称作TbD1的基因位点，在现有的大多数结核分枝杆菌中没有该基因的存在。因此，基因缺失在牛分枝杆菌基因组形成中可能起到了至关重要的作用。[0005]实时荧光定量PCR(real-timefluorogeneticquantitativePCR)是在定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR体系中加入荧光基团，利用