重组质粒构建.pptx

DNA重组质粒的构建基因克隆genecloning应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。核心技术：DNA重组技术（recombinantDNAtechnique）基因克隆的基本程序：分—切—接—转—筛PCR酶切连接转化&转染抗性或标记筛选目的基因DNA片段的获得外源DNA分子与载体DNA分子的体外重组重组DNA分子转移到适当的受体菌或细胞重组DNA分子克隆的筛选和鉴定目的基因或其表达产物的纯化和鉴定基因克隆技术的特点：1.可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。基因克隆示意图胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体例：干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取0.05μg干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的DNA结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低。DNA重组操作过程重组质粒构建：目的DNA的PCR扩增DNA片段和载体的酶切片段DNA与载体的连接载体：plasmid（primary）工具酶：限制性内切酶连接酶常见的基因工程载体载体的基本结构单元：1.复制起点2.克隆位点3.筛选标记其他条件：4.适当大小5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。质粒(Plasmid)通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。质粒DNA的特征（四）人工构建质粒的基本元件pBR322plasmid是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：复制起点:Ori克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI筛选标记:Ampr。T-vectorPCR产物亚克隆载体T—Vector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。T-vector克隆PCR产物时用高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内(30分钟～1小时)完成连接反应，大大地方便了实验操作。用途克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物使用M13primers进行DNA测序。原核生物表达载体Bacterialexpressionvector复制起点克隆位点筛选标记启动子﹡转录终止序列﹡核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序列（翻译识别）真核生物表达载体（mammalianexpressionvector)真核生物表达载体的结构单元LocationofFeaturesPCMVIE:CMVIEenhancer:1-659CMVIEpromoter:669-750Interveningsequence(IVS):890-1022T7RNApolymerasepromoter:1067-1085Multiplecloningsite:1085-1137T3RNApolymerasepromoter:1158-1137SV40fragmentcontainingpolyadenylationsignal:1167-1388f1originofreplication:1483-1938EGFPexpressioncassette:2002-3455SV40enhancer/earlypromoter:2002-2420EGFPstructuralgene:2449-3168Kozakconsensustranslationinitiationsi