一种引物探针组及其应用和一种检测蜜蜂慢性麻痹病毒的试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112458206A(43)申请公布日2021.03.09(21)申请号202011338417.0(22)申请日2020.11.25(71)申请人福州海关技术中心地址350003福建省福州市鼓楼区湖东路312号国检广场(72)发明人张体银郑腾黄嫦娇王武军张志灯于师宇(74)专利代理机构北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙)11732代理人周新楣(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表1页附图3页(54)发明名称一种引物探针组及其应用和一种检测蜜蜂慢性麻痹病毒的试剂盒(57)摘要本发明属于生物技术领域，本发明提供了一种引物探针组及其应用和一种检测蜜蜂慢性麻痹病毒的试剂盒。本发明提供的引物探针组，包括上游引物、下游引物和TaqMan探针；本发明提供的引物探针组用于蜜蜂慢性麻痹病毒的检测。本发明具有以下优点：(1)良好的稳定性和特异性：对蜜蜂慢性麻痹病毒的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病毒无交叉反应，且重复性好；(2)灵敏度高：灵敏度能达到约10拷贝/μL；(3)操作简便、快速：整个反应可在60min内完成；本发明提供的引物探针组及其试剂盒用于蜜蜂慢性麻痹病毒的检测以及与其他蜜蜂病毒病的鉴别诊断，对于保障我国养蜂业和自然生态的健康发展具有重要意义。CN112458206ACN112458206A权利要求书1/1页1.一种引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括上游引物、下游引物和TaqMan探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述TaqMan探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述TaqMan探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。3.一种权利要求1或2所述的引物探针组在制备检测蜜蜂慢性麻痹病毒试剂盒中的应用。4.一种检测蜜蜂慢性麻痹病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、10×RT-PCRbuffer缓冲液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶和RNA抑制剂。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有目的片段的阳性克隆质粒，所述目的片段如SEQIDNO.4所示；所述阴性对照品为无核酸酶水。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在实时荧光RT-PCR的反应体系中的配置为：10×RT-PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl22μL，2.5mmol/LdNTPs1.5μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，10μmol/L探针0.5μL，5U/μLDNA聚合酶0.5μL，5U/μL逆转录酶0.5μL，40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL，待测样品RNA2μL，然后加入无核酸酶水9.5μL，使反应总体积为20.0μL。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光RT-PCR的反应程序为：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，55～65℃退火30s，共40～45个循环。2CN112458206A说明书1/4页一种引物探针组及其应用和一种检测蜜蜂慢性麻痹病毒的试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种引物探针组及其应用和一种检测蜜蜂慢性麻痹病毒的试剂盒。背景技术[0002]蜜蜂慢性麻痹病又叫黑蜂病、瘫痪病，是由蜜蜂慢性麻痹病毒(chronicbeeparalysisvirus，简称CBPV)引起的一种成年蜜蜂传染病。该病全年都可发生，大多在春秋季流行，传染很快，病情严重，顽固难治。[0003]CBPV主要侵袭成年工蜂，被CBPV感染的蜂群可同时出现2种典型的麻痹病症，即Ⅰ型麻痹综合症和Ⅱ型麻痹综合症。Ⅰ型麻痹综合症表现为患病蜜蜂身体和双翅不正常的震颤，失去飞行能力，只能爬行。伴有腹部肿胀、下痢和双翅无法闭合等明显的病症。患病蜜蜂个体出现病症后数日内死亡。严重时使得蜂群崩溃，多发于盛夏高温季节。Ⅱ型麻痹综合症又被称为“黑盗蜂”、“黑小蜂”或“脱毛黑蜂症”等。患病蜜蜂个体初期具有飞行能力，身体绒毛逐渐脱落，体色加深变黑。病蜂个体看起来比健康蜜蜂小，并有一个相对突出、有油亮光泽的腹部。可观察到被同群健康蜜蜂攻击的现象，类似盗蜂时的进攻行为。数日后，染病蜜蜂出现失去飞行能力、身体不停颤抖等麻痹症状，之后在短时间内死亡。蜜蜂缓慢性麻痹病毒病全年均可发生，但多在春夏