一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102965451A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102965451A(43)申请公布日2013.03.13(21)申请号201210360340.6(22)申请日2012.09.25(71)申请人珠海国际旅行卫生保健中心地址519020广东省珠海市拱北侨光路133号(72)发明人莫秋华伍碧梅赵俊华杨泽谭华林继灿杜田(74)专利代理机构广州市红荔专利代理有限公司44214代理人王贤义(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书权利要求书22页页说明书说明书99页页序列表序列表22页页附图附图33页页(54)发明名称一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针(57)摘要本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）技术的肠道病原体快速检测技术。具体提供了一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其一对引物和一条分子信标探针。所述试剂盒包括含有上述引物和探针的2×实时NASBA反应液、5×酶混合液及阳性对照模板、阴性对照和空白对照。所述引物和探针序列是序列编号为SEQIDNO：1～3所示的序列，能特异性扩增和检测A组轮状病毒VP6基因。本发明的试剂盒具有快速、高效、敏感特异和实时检测分析等特点，可应用于临床和口岸的常规检测和疾病防控领域。CN1029654ACN102965451A权利要求书1/2页1.一种A组轮状病毒检测用引物，其特征在于，包括正向引物F1和反向引物R1，所述正向引物F1和所述反向引物R1的碱基序列表示如下：正向引物F1：5’-AACATCATGCWACRGTWGGACT-3’；反向引物R1：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCAGATGGTTAGYYTGGTCCTYA-3’。2.根据权利要求1所述的一种A组轮状病毒检测用引物，其特征在于：所述反向引物R1的5’端的25个碱基是增加的T7噬菌体启动子序列，而3’端22个碱基是与A组轮状病毒VP6基因靶RNA互补的特异性序列，所述正向引物F1和所述反向引物R1的3’端的病毒核酸变异位点使用简并碱基。3.一条A组轮状病毒检测用分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列表示如下：分子信标探针P1：5’-FAM-CGATCGTATGCNRTACCRGTTGGACCCGATCG-DABCYL-3’，所述分子信标探针P1在其寡核苷酸DNA分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。4.根据权利要求3所述的一条A组轮状病毒检测用分子信标探针，其特征在于：所述分子信标探针P1的5’端和3’端的6个碱基是形成探针特征性发夹结构茎端区的反向互补序列，探针分子中间的20个碱基是与A组轮状病毒VP6基因互补的特异性序列，其中病毒核酸变异位点使用简并碱基。5.一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒至少包括2×实时NASBA反应液和5×酶混合液，所述2×实时NASBA反应液包含有如权利要求1所述的正向引物F1和反向引物R1以及如权利要求3所述的分子信标探针P1。6.根据权利要求5所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述2×实时NASBA反应液包括如下组分：2CN102965451A权利要求书2/2页7.根据权利要求5所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述5×酶混合液包括如下组分：8.根据权利要求5所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和空白对照。9.根据权利要求8所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为A组轮状病毒体外转录的VP6基因RNA片段。10.根据权利要求8所述的一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为在核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。3CN102965451A说明书1/9页一种A组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针技术领域[0001]本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）技术的肠道病原体快速检测技术。具体涉及A组轮状病毒实时NASBA等温扩增快速检测试剂盒；还涉及所述试剂盒中使用的对于A组轮状病毒VP6基因具有特异性的引物对和分子信标探针。背景技术[0002]A组轮状病毒（Rotavirus，RV）是世界范围内引起婴幼儿重症腹泻的最主要病原，占儿科肠道感染病因的5