含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102618583A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102618583A(43)申请公布日2012.08.01(21)申请号201210080915.9(22)申请日2012.03.24(71)申请人广西壮族自治区肿瘤防治研究所地址530021广西壮族自治区南宁市青秀区河堤路71号(72)发明人李力刘芳张玮(74)专利代理机构广西南宁公平专利事务所有限责任公司45104代理人杨立华(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书权利要求书22页页说明书说明书88页页序列表序列表1010页页附图附图44页页(54)发明名称含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框(ORF)，插入慢病毒表达载体pWPI，构建重组抗p185erbB2全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI/H-F2A-L。经测序鉴定，pWPI/H-F2A-L与预期设计一致。重组慢病毒的感染效率分别为87.68％，感染293T细胞后，有嵌合重链和嵌合轻链的表达。与含IRES的嵌合抗体慢病毒表达载体进行比较，由F/2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体，为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。CN1026853ACN102618583A权利要求书1/2页1.一种含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于该载体是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分别是抗p185erbB2人鼠嵌合抗体重链基因和抗p185erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。2.根据权利要求1所述的含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于：所述抗p185erbB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人p185erbB2单抗重链可变区基因vH和人IgG1的重链恒定区基因γ1连接而成；所述抗p185erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人p185erbB2单抗轻链可变区基因vL和人IgG1的轻链恒定区基因κ连接而成。3.根据权利要求1所述含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框ORF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。4.根据权利要求3所述含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：<1>抗p185erbB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗p185erbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNATaq酶作用下分别用H-A和gamma1-B、L-A和Kappa-B扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L；扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min；PGR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因；<2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建①接头片段F2A的合成该片段由3部分构成：含NsiI酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列；②中间质粒pUC57/F2A的构建将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamHI和XbaI之间，获得中间质粒pUC57/F2A；③含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L的构建用BamHI和XbaI双酶切质粒pUC57/F2A，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收接头片段F2A和载体片段pUC57；进而用PvuII酶切接头片段F2A，获得5’端为BamHI酶切位点和3’端为PvuII酶切位点的接头片段F2A；用PvuII和XbaI双酶切嵌合轻链L，获得5’端为PvuII酶切位点和3’端为XbaI位点的轻链片段L；然后，将这两个片段用T4DNA连接酶连接后克隆入载体pUC57，获得含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L；④片段H-F2A-L的拼接用BamHI酶和XbaI酶切pUC57/F2A-L，获得片段F2A-L；进而用NsiI酶切片段F2A-L，获得5’端为NsiI酶切位点和3’端为XbaI酶切位点的片段F2A-L；用BamHI和