抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102618582A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102618582A(43)申请公布日2012.08.01(21)申请号201210079950.9(22)申请日2012.03.24(71)申请人广西壮族自治区肿瘤防治研究所地址530021广西壮族自治区南宁市青秀区河堤路71号(72)发明人李力刘芳张玮(74)专利代理机构广西南宁公平专利事务所有限责任公司45104代理人杨立华(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书权利要求书22页页说明书说明书88页页序列表序列表99页页附图附图44页页(54)发明名称抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，利用PCR法扩增出抗人p185erbB2鼠源性单抗可变区基因(vH和vL)和人IgG1的恒定区基因(γ1和κ)，再采用三引物PCR法将vH和γ1，vL和κ进行拼接，得到嵌合重链(H)和嵌合轻链(L)基因，分别插入质粒pVAX1/IRES的IRES元件的上、下游，用内切酶将H-IRES-L从pVAX1/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，构建成慢病毒表达pWPI/H-IRES-L。经相应酶切和测序鉴定，与预期设计一致。转染293T细胞后，有嵌合重链和嵌合轻链基因的共同表达，而且嵌合抗体能够与p185erbB2分子特异性结合。本发明为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。CN102685ACN102618582A权利要求书1/2页1.一种抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于该载体是pWPI/H-IRES-L，其中H和L分别是抗p185erbB2人鼠嵌合抗体重链基因和抗p185erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因。2.根据权利要求1所述抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：利用PCR法扩增出抗人p185erbB2鼠源性单抗可变区基因vH和vL以及人IgG1的恒定区基因γ1和κ；再采用三引物PCR法将vH和γ1，vL和κ进行拼接，得到嵌合重链H和嵌合轻链L基因，分别插入质粒pVAX1/IRES的IRES元件的上、下游；用内切酶将H-IRES-L从pVAX1/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，即得。3.根据权利要求2所述抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：<1>鼠抗人p185erbB2单抗轻、重链可变区基因vL、vH和人IgG1轻、重链恒定区基因κ、γ1的扩增以质粒pSRNC/Cκ-ZC26为模板，在TaqDNA聚合酶作用下分别用L-A和L-B、Kappa-A和Kappa-B扩增出带信号肽的轻链可变区基因vL和人IgG1轻链恒定区基因κ；以质粒pSRDC/Cγ1-ZC26为模板，在TaqDNA聚合酶作用下分别用H-A和H-B、gamma1-A和gamma1-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH和人IgG1重链恒定区基因γ1；扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min30s，35个循环，72℃延伸10min；用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物；<2>嵌合轻链基因L和嵌合重链基因H的拼接按照三引物PCR法，以vL和κ为模板，用HiFiTaqDNA聚合酶将两者拼接成嵌合轻链基因L；以vH和γ1为模板，用HiFiTaqDNA聚合酶将两者拼接成嵌合重链基因H；第一步：在加入模板vL和κ或vH和γ1，不加引物的情况下，94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，10个循环；第二步：加入引物L-A和Kappa-B或H-A和gamma1-B，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min15s，35个循环，72℃延伸10min；TP-PCR拼接产物嵌合轻链L或嵌合重链H经过胶回收试剂盒纯化回收后克隆至EZ-T载体，进一步测序验证；<3>中间质粒pVAX1/H-IRES-L的构建用NsiI和XbaI酶切嵌合轻链L的PCR产物以及质粒PVAX1/IRES，分别经琼脂糖凝胶电泳，纯化回收后，在T4连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化DH-5α感受态细菌，抽提质粒后经PCR和酶切鉴定，筛选出阳性克隆；进而用BamHI和PvuI酶切嵌合重链H的PCR产物以及含有嵌合轻链的质粒pVAX1/IRES-L，按上述实验步骤构建并筛选出含嵌合重链的阳性克隆，经基因测序验证，获得共表达嵌合轻、重链的重组质粒pVAX1/H-IRES-L；<4>慢病毒表达质粒pWPI/H