一种地皮菜水应激蛋白基因及其重组蛋白的制备和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103409435A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103409435103409435A(43)申请公布日2013.11.27(21)申请号201310291766.5(22)申请日2013.07.11(71)申请人山西大学地址030006山西省太原市小店区坞城路92号(72)发明人李卓玉郭松佳李宗伟李汉卿单树花(74)专利代理机构山西五维专利事务所(有限公司)14105代理人杨耀田(51)Int.Cl.C12N15/31(2006.01)C12N15/70(2006.01)C07K14/405(2006.01)C07K1/22(2006.01)A61K38/16(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书3页说明书3页A61P35/00(2006.01)序列表4页序列表4页附图2页附图2页(54)发明名称一种地皮菜水应激蛋白基因及其重组蛋白的制备和应用(57)摘要发明提供了从地皮菜中克隆一种新的水应激蛋白基因以及克隆、表达纯化出相应蛋白的方法：Trizol法提取地皮菜组织mRNA，在体外反转录成cDNA，根据Genebank中地皮菜水应激蛋白家族基因的同源序列设计引物，用PCR方法扩增地皮菜水应激蛋白基因序列；将基因序列与pET28a载体连接，构建pET28a-wsp重组质粒，转化E.coliBL21感受态细胞，诱导表达目的蛋白，经亲和纯化、脱盐和浓缩后得到。采用MTT法检测，表明该蛋白具有抗肿瘤活性。CN103409435ACN103495ACN103409435A权利要求书1/1页1.一种地皮菜水应激蛋白基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：1。2.一种地皮菜水应激重组蛋白，其氨基酸序列是SEQIDNO：2。3.一种地皮菜水应激重组蛋白的表达和纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将地皮菜藻体组织在液氮中磨成粉末，Trizol法提取总RNA，利用反转录酶获得cDNA模板；（2）根据Genebank中地皮菜水应激蛋白家族基因的同源序列设计上游引物SEQIDNO：3和下游引物SEQIDNO：4；以cDNA为模板，建立PCR反应体系，回收PCR产物测序鉴定；（3）PCR产物经BamHI和XholI双酶切，与同样经过双酶切的pET28a载体连接，转化E.coliBL21感受态细胞，获得重组菌株E.coliBL21(pET28a-wsp)；（4）重组菌株E.coliBL21(pET28a-wsp)培养过夜，转接于含卡那霉素的LB培养基中，继续震荡培养3h，加0.5mMIPTG诱导，并继续培养4h,收集菌体；（5）将预装填料Ni-NTAresin加到空柱子中，平衡柱子；再将菌体破碎、离心后的上清加到层析柱中进行亲和纯化；（6）用平衡缓冲液洗脱非特异性结合的杂蛋白，再用含40-300mM咪唑PH为7.4的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，经2次纯化，收集100-300mM洗脱液并用PBS缓冲液过夜透析，加入lOkD超滤管中，离心，获得蛋白溶液，保存于-80℃。4.如权利要求2所述的一种地皮菜水应激重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。2CN103409435A说明书1/3页一种地皮菜水应激蛋白基因及其重组蛋白的制备和应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种地皮菜水应激蛋白（waterstressprotein，wsp）基因、重组蛋白及其应用。背景技术[0002]地皮菜，学名普通念珠藻（NostoccommuneVauch.），别名地耳、地踏菇、地衣、地木耳、地软等，为蓝藻科念珠藻属的片状藻类，喜欢生长在潮湿的土壤表面，或混于杂草基部的茎叶间、大树的基部以及苔藓植物群中，几乎在全国各地都有分布。历来民间有食用地皮菜的习惯，但对其开发研究的不多，地皮菜的营养价值可同木耳、发菜相媲美，它富含蛋白质、糖类、矿物质、维生素及钙、磷、铁等多种营养成分。此外，还含有特殊的活性成分如蓝藻蛋白、胞外多糖等。因此，地皮菜是一种兼有医疗和食疗功能的野生美味佳肴。发明内容[0003]本发明的目的在于利用基因工程技术，提供一种地皮菜水应激蛋白基因、重组蛋白及其制备方法，以及重组蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。[0004]本发明提供的一种地皮菜水应激蛋白基因，其核苷酸序列是SEQIDNO：1。[0005]本发明提供的一种重组地皮菜水应激蛋白，其氨基酸序列是SEQIDNO：2。[0006]重组地皮菜水应激蛋白的表达和纯化方法，步骤包括：[0007]（1）将地皮菜藻体组织在液氮中磨成粉末，Trizol法提取总RNA，利用反转录酶获得cDNA模板；[0008]（2）根据Genebank中地皮菜水应激蛋白家族基因的同源序列设计上游引物SEQIDNO：3和下游引物SEQIDNO：4