重组胶原蛋白、制备方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114106150A(43)申请公布日2022.03.01(21)申请号202111470250.8C12N15/12(2006.01)(22)申请日2021.12.03C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)(83)生物保藏信息C12P21/02(2006.01)CGMCCNO.218912021.03.11C07K1/18(2006.01)CGMCCNO.218922021.03.11C12N5/077(2010.01)(71)申请人江苏创健医疗科技有限公司A61L27/24(2006.01)地址213163江苏省常州市金坛区双龙路A61L27/52(2006.01)28号C12R1/84(2006.01)(72)发明人李佳佳王丽萍刘慧敏蒋雯雯钱晨明程鹏飞钱松(74)专利代理机构南京智造力知识产权代理有限公司32382代理人陈佳佳(51)Int.Cl.权利要求书2页说明书19页C07K14/78(2006.01)序列表28页附图11页(54)发明名称重组胶原蛋白、制备方法及其应用(57)摘要本发明涉及重组胶原蛋白、制备方法及其应用，尤其涉及重组表达的全长的胶原蛋白α1链、制备方法及其应用，属于胶原蛋白表达技术领域。本发明中构建的人Ⅰ型胶原蛋白α1链(α1(Ⅰ)链)的变体(记为α1(Ⅰ)M1)和人Ⅱ型胶原蛋白α1链(α1(Ⅱ)链)的变体(记为α1(Ⅱ)M6)于毕赤酵母中重组表达时，均消除了天然全长的α1(Ⅰ)链、α1(Ⅱ)链重组表达时出现的与全长α1链目的产物(目的条带)占比量基本相同的主降解产物(主降解条带)，提高了目的产物的产率，且与毕赤酵母中重组表达的天然全长的α1(Ⅰ)链胶原蛋白与α1(Ⅱ)链胶原蛋白相比有类似的理化特征和生物学活性，均有应用于生物医学材料领域的价值。CN114106150ACN114106150A权利要求书1/2页1.重组胶原蛋白α1链，其特征在于，所述重组胶原蛋白α1链包括α1(Ⅰ)M1或α1(Ⅱ)M6，所述α1(Ⅰ)M1由人Ⅰ型胶原蛋白α1链的天然全长氨基酸序列经过氨基酸突变获得，所述α1(Ⅱ)M6由人Ⅱ型胶原蛋白α1链天然全长氨基酸序列经过氨基酸突变获得。2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白α1链，其特征在于，所述α1(Ⅰ)M1的氨基酸突变的位点数为4；所述α1(Ⅱ)M6的氨基酸突变位点数为9。3.根据权利要求2所述的重组胶原蛋白α1链，其特征在于，所述人Ⅰ型胶原蛋白α1链为SEQ.NO.ID.1所示，所述氨基酸突变的位点为第106位的M、109位的R、190位的M、193位的R；所述人Ⅱ型胶原蛋白α1链为SEQ.NO.ID.4所示，所述氨基酸突变的位点为第67位的V、68位的M、72位的M、75位的M、78位的R、108位的M、111位的R、162位的M、165位的R。4.根据权利要求3所述的重组胶原蛋白α1链，其特征在于，所述人Ⅰ型胶原蛋白α1链氨基酸突变具体为第106位的M、109位的R、190位的M、193位的R，均改变为P；所述人Ⅱ型胶原蛋白α1链氨基酸突变具体为第67位的V、68位的M、72位的M、75位的M、78位的R、108位的M、111位的R、162位的M、165位的R，均改变为P。5.根据权利要求4所述的重组胶原蛋白α1链，其特征在于，所述α1(Ⅰ)M1的序列如SEQ.NO.ID.2所示，所述α1(Ⅱ)M6的序列如SEQ.NO.ID.5所示。6.编码权利要求1‑5任一项所述重组胶原蛋白α1链的核苷酸。7.根据权利要求6所述的核苷酸，其特征在于，所述编码α1(Ⅰ)M1的核苷酸序列如SEQ.NO.ID.3；所述编码α1(Ⅱ)M6的核苷酸序列如SEQ.NO.ID.6所示。8.重组表达载体，含有权利要求6所述的核苷酸。9.工程菌，所述工程菌含有权利要求8所述的重组表达载体或表达权利要求1‑5任一项所述重组胶原蛋白α1链，所述工程菌为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。10.根据权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.21891或CGMCCNO.21892，其中保藏编号为CGMCCNO.21891的工程菌表达的是重组α1(Ⅰ)M1胶原蛋白α1链，保藏编号为CGMCCCGMCCNO.21892的工程菌表达的是重组α1(Ⅱ)M6胶原蛋白α1链。11.权利要求8所述的重组表达载体或权利要求9‑10任一项所述的工程菌在制备所述重组胶原蛋白α1链中的应用。12.权利要求1‑5任一项所述重组胶原蛋白α1链的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成编码权利要求1‑5任一项所述重组胶原蛋白α1