一种多肽片段以及制备方法和用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号CN103571803B(45)授权公告日2018.05.11(21)申请号201310471571.9A61P5/50(2006.01)(22)申请日2013.10.11(56)对比文件(65)同一申请的已公布的文献号CN102807612A,2012.12.05,申请公布号CN103571803ACN102838669A,2012.12.26,JunhanWang等.Purificationand(43)申请公布日2014.02.12characterizationofnoveltruncated(73)专利权人中南民族大学fragmentsofbioactiveproteinsfrom地址430074湖北省武汉市洪山区民族大porcineintestinewitheffectsoninsulin道708号中南民族大学secretion.《ScientificResearchand(72)发明人李臣鸿陈正望Essays》.2012,第7卷(第34期),3026-3031.(74)专利代理机构武汉华旭知识产权事务所审查员邢维玲42214代理人刘荣(51)Int.Cl.C12N9/02(2006.01)权利要求书1页说明书3页A61K38/10(2006.01)序列表1页(54)发明名称细胞色素c氧化酶Ⅷ52-69及其制备方法和功能(57)摘要本发明提供了一种多肽片段，经检测后发现其为细胞色素C氧化酶Ⅷ(cytochromeCoxidasesubunitⅧ)的一个片段，由细胞色素C氧化酶Ⅷ的52-69位的氨基酸残基组成，我们记作COX52-69。其氨基酸序列为：LLPAGWVLSHLDSYKKRE。经实验证明该多肽片段具有抑制胰岛分泌胰岛素的作用。CN103571803BCN103571803B权利要求书1/1页1.一种多肽，其氨基酸序列如下：LLPAGWVLSHLDSYKKRE。2.权利要求1所述多肽在用于制造抑制胰岛分泌胰岛素的药物中的用途。2CN103571803B说明书1/3页细胞色素c氧化酶Ⅷ52-69及其制备方法和功能技术领域[0001]本发明涉及一种细胞色素C氧化酶Ⅷ(cytochromeCoxidasesubunitⅧ)截短后的片段COX52-69，该多肽片段具有抑制胰岛分泌胰岛素的作用，本发明同时还提供了上述多肽片段的制备方法。背景技术[0002]细胞色素c氧化酶是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的关键酶。它承担着细胞色素c(Cytoehroinec，cytc)到氧分子(0：)的电子传递功能，催化氧分子还原为水分子，并与质子泵功能相偶联。所有哺乳动物真核细胞的COX由13个亚基组成，其中构成级联反应核心的最大3个亚基(COXI、II和111)由mtDNA编码。其余10个亚基(C0IV，Va,Vb，Via,Ⅵb，Ⅵc，Ⅶa.Ⅶb，Ⅶc，和Ⅷ)均由nDNA编码，即由细胞核内基因经胞浆中的核糖体翻译后经过不同途径转运至线粒体的。这10个亚基有明显的种族和器官特异性，其功能尚不明确。要形成功能复合物，需要COX所有结构基因的表达以及超过24个COX特异基因的参与，这些特异基因可以影响COX合成的所有方面，尤其在COX全酶装配和稳定中起着重要作用。但有关在线粒体中酶是怎样装配，目前尚不清楚。所以总体来说目前还不知道细胞色素C氧化酶Ⅷ的功能。发明内容[0003]本发明提供了一种多肽片段，经检测后发现其为细胞色素C氧化酶Ⅷ截断后的片段，由细胞色素C氧化酶Ⅷ的52-69位的氨基酸残基组成，其氨基酸序列如下：LLPAGWVLSHLDSYKKRE。[0004]本发明提供了上述多肽的制备方法，包括以下步骤：(1)、将猪肠道洗净后浸入沸水中浸泡3-7分钟，浸泡完成后取出冷冻并剁碎，然后在0～10℃条件下用醋酸对肠道进行浸取后过滤得浸出液，用盐酸对浸出液中的浸出物洗脱并抽滤得耐热肠多肽；[0005](2)、将耐热肠多肽溶解于水中，加入抗氧化剂及足量异丙醇溶液，室温下充分静置后离心除去沉淀，然后再加入足量温度为-25℃～-15℃的异丙醇溶液并在-25℃～-15℃条件下充分静置后抽滤去除沉淀，将所得滤液的PH值调节为5.8～6.1，再在-25℃～-15℃条件下充分静置后抽滤得白色沉淀，将白色沉淀充分洗涤后即制得粗肽；[0006](3)、将步骤(2)中制得的粗肽溶液于醋酸溶液中制得肽溶液，将肽溶液过柱层析分离得到所要分离物，将分离物冻干得粗提取物；[0007](4)、将粗提取物溶解于碳酸氢铵溶液中并搅拌，离心后去除沉淀得上清液，将所得上清液过柱层析并采用PH值为8.0、浓度为0.02mol/L的碳酸氢铵溶液进行洗涤，洗涤后得到的洗涤物冻干，再将洗涤物经过两次高