用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110016524A(43)申请公布日2019.07.16(21)申请号201910454967.X(22)申请日2019.05.29(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山街五山路483号(72)发明人贺东生冯军森苏丹萍谢永生司广斌李锦辉周霞(74)专利代理机构广州独角熊知识产权代理事务所(特殊普通合伙)44580代理人张小黎(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6848(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书6页序列表2页附图8页(54)发明名称用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒(57)摘要本发明提供用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物、方法及试剂盒。本发明提供的试剂盒根据猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计多组套式PCR引物，并通过引物筛选以及反应体系优化，研制出一种检测灵敏性高、特异性好的套式PCR检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒只需要一台普通PCR仪，即可获得与实时荧光定量PCR相当的检测灵敏性，不仅可监测捷申病毒的微量潜伏感染，实现对猪捷申病的早期预警，同时检测成本低，对检测仪器设备与人员操作水平要求较低，利于在养殖生产一线得到应用和推广。CN110016524ACN110016524A权利要求书1/2页1.用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪捷申病毒的高度保守的特异性序列设计套式PCR引物，其中，检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的外引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；检测猪捷申病毒的套式PCR引物中的内引物，由SEQIDNO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成。2.用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品中提取核酸模板；2)将如权利要求1所述的套式PCR引物的外引物加入到套式PCR的第一轮反应体系中扩增检测步骤1)所得核酸模板，得第一轮PCR扩增产物；3)将如权利要求1所述的套式PCR引物的内引物以及上述步骤2扩增所得的第一轮PCR扩增产物加入到套式PCR的第二轮反应体系中扩增检测步骤2)所得第一轮PCR扩增产物，得第二轮扩增产物；4)第二轮扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。3.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第一轮反应体系总体积为25μl，包括：20μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示核苷酸序列各0.375μl，PrimeScript1StepEnzymeMix1μl，2×1StepBuffer(DyePlus)12.5μl，TemplateRNA3μl，RNaseFreedH2O7.375μl。4.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第一轮反应条件包括：50℃，30min；94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。5.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第二轮反应体系总体积为25μl，包括：20μM的SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示核苷酸序列各0.375μl，ExTaqVersion2.0plusdye12.5μl，第一轮PCR扩增产物2μl，ddH2O9.375μl。6.如权利要求2所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测方法，其特征在于，所述用于检测猪捷申病毒的套式PCR的第二轮反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃终延伸5min。7.用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR引物，还包括第一轮反应试剂、第二轮反应试剂，其中第一轮反应试剂包括：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示核苷酸序列，PrimeScript1StepEnzymeMix，2×1StepBuffer(DyePlus)，RNaseFreedH2O；第二轮反应试剂包括：SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示核苷酸序列，ExTaqVersion2.0plusdye，ddH2O。8.如权利要求7所述的用于检测猪捷申病毒的套式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述套式PCR检测试剂盒对猪捷申病毒的最低检出量可低至