一种提取并纯化聚羟基脂肪酸酯的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111019108A(43)申请公布日2020.04.17(21)申请号202010012479.6(22)申请日2020.01.07(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华园1号(72)发明人陈国强张李湛叶健文吴赴清司徒卫(74)专利代理机构中科专利商标代理有限责任公司11021代理人吴小明(51)Int.Cl.C08G63/90(2006.01)C08G63/08(2006.01)权利要求书1页说明书8页(54)发明名称一种提取并纯化聚羟基脂肪酸酯的方法(57)摘要聚羟基脂肪酸酯(PHA)的现有提取纯化方法包括有机溶剂或者表面活性剂加水解酶等，过程复杂昂贵。本发明通过对富含PHA的细菌发酵液进行热水或100℃以上过热水处理，完成对细菌细胞的破壁和提纯，并且还可以结合表面活性剂、蛋白酶和/或漂白剂处理等，进一步提高PHA的纯度。本发明成本低廉，操作简单，产品回收率高，而且克服了传统PHA提取步骤繁杂、添加化学物质成本高昂、下游污水难以处理等问题。CN111019108ACN111019108A权利要求书1/1页1.一种从生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物菌体中提取PHA的方法，包括以下步骤：用热水或过热水处理所述微生物菌体，以获得菌体破壁裂解液。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述热水或过热水的温度为60℃-200℃，优选80℃-160℃，还优选100℃-140℃，更优选100℃-130℃，最优选大于100℃-125℃。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中用热水或过热水处理所述微生物菌体是在以下压力下进行：0.1-30MPa(例如0.12-0.15MPa)，优选0.5-20MPa，更优选1-10MPa，最优选1.5-5MPa。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在pH7-11下用热水或过热水处理所述微生物菌体。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在所述热水或过热水中加入0.1-2v/v％的甘油。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，进一步包括用蛋白酶处理所述菌体破壁裂解液，优选地其中所述蛋白酶选自由以下组成的组：蛋白酶K、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、SUMO蛋白酶、或它们的组合。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括用漂白剂处理在用蛋白酶处理所述菌体破壁裂解液之后得到的溶液。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述漂白剂选自由以下组成的组：过氧化氢、次氯酸钠、亚硫酸钠、二氧化硫脲、二氧化氯、或它们的组合。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，进一步包括洗涤、过滤、离心和/或干燥步骤，以得到纯化的聚羟基脂肪酸酯(PHA)。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述聚羟基脂肪酸酯(PHA)选自短链PHA如聚羟基丙酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯(PHBV)、3-羟基丁酸和-4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)、中长链PHA(单体为C6-C18的羟基酯)以及短链和中长链PHA共聚物。2CN111019108A说明书1/8页一种提取并纯化聚羟基脂肪酸酯的方法技术领域[0001]本发明属于生物工程下游后处理领域，特别是聚羟基脂肪酸酯(PHA)的生产与下游提取与纯化工艺。背景技术[0002]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一种可以由多种细菌积累的可降解聚酯，根据其单体组成，可分为短链/或中长链PHA，也有均聚物和共聚物。PHA是一种环境友好型材料，有着广泛的应用前景，可以作为传统石油基塑料的环保替代品。其中，聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)是目前PHA家族成员中研究的最为清楚的，但它的应用却受到自身结晶度高、弹性低、柔韧度差等的限制。目前工业上经常使用生物发酵的方法7,8，来获得富含PHA的细菌，然后进行复杂的提纯工作3,4,6。[0003]PHA生产是以罗氏真氧杆菌(Ralstoniaeutropha)、基因改造的大肠杆菌(E.coli)和嗜盐菌等来进行的。虽然发酵液中菌体富含PHA，但是PHA的提取和纯化除杂工艺很复杂，有些还用到有机溶剂，造成PHA成本昂贵。PHA的性能和其纯度有着非常大的关系。不同的用途对纯度的要求也各不相同。其中，医疗等领域对纯度要求非常高。但是，PHA作为细菌内含物，胞内成分相当复杂，提取纯化难度很大。[0004]已有的提取工艺包括有机溶剂抽提法、机械破碎法、表面活性剂法和多种酶结合的方法等。但都有其局限性：有机溶剂抽提法溶剂回收困难，成本高昂，且操作环境危险，不适合大规模生产；机械破碎法主要包括超声波破壁或者高压匀浆破壁，能耗大，产品损