聚羟基脂肪酸酯的高纯度提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113354802A(43)申请公布日2021.09.07(21)申请号202110579418.2(22)申请日2021.05.26(71)申请人清华大学地址100084北京市海淀区清华园1号(72)发明人陈国强杨宏宇吴赴清(74)专利代理机构北京知联天下知识产权代理事务所(普通合伙)11594代理人史光伟张迎新(51)Int.Cl.C08G63/78(2006.01)C08G63/06(2006.01)C12N1/06(2006.01)权利要求书1页说明书10页附图3页(54)发明名称聚羟基脂肪酸酯的高纯度提取方法(57)摘要本发明提供了一种从菌体中提取聚羟基脂肪酸酯的方法，具体的，将来源于细菌发酵获得的聚羟基脂肪酸酯PHA，通过优化破壁条件(温度、pH、菌液浓度、破壁助剂及保护剂等)进行高效破壁，并进行酶解实现PHA的高回收率和高纯度提取。用该方法获得的多种PHA产品回收率达96％以上，纯度达95％以上，分子量达到初始分子量的30％以上。CN113354802ACN113354802A权利要求书1/1页1.一种从菌体中提取聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，加入山梨醇进行破壁，获得破壁裂解液，向破壁裂解液中加入酶进行酶解，获得酶解液，对酶解液进行固液分离获得聚羟基脂肪酸酯，其中，所述的酶为蛋白酶、溶菌酶和核酸降解酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括按照体积比0.1‑1％向细胞液中加入山梨醇，优选按照体积比0.5％向细胞液中加入山梨醇。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破壁的pH值为5‑11.5，优选为8.5‑10.5；所述破壁的温度为60‑90℃，优选为60‑85℃；所述破壁的时间为10‑200min，优选为50‑120min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚羟基脂肪酸酯选自单体为C3‑C5的羟基脂肪酸的短链PHA、单体为C6‑C18的羟基脂肪酸的中长链PHA、以及短链和中长链PHA共聚物。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菌体选自嗜盐菌、盐单胞菌、兽气单胞菌、卡巴耶罗氏菌株、木质素降解细菌或巨大产碱杆菌DSM。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶；优选的，按照质量比0.1％加入酶；优选的，所述酶解的温度为40‑60℃，进一步优选为45‑50℃；优选的，所述酶解的时间为10‑200min，进一步优选为50‑120min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的加入酶之前还包括离心、洗涤的步骤，优选的，洗涤1‑10次，进一步优选的，洗涤2‑5次。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的对酶解液进行固液分离步骤包括一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯，其中，所述的干燥选自冷冻干燥、喷雾干燥、流化床、转鼓干燥或沸腾床。9.根据权利要求1‑8任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：A)从发酵液中分离获得菌体，将菌体重悬于水中获得细胞液，按照体积比0.1‑1％加入山梨醇，调节pH值为5‑11.5，加热至60℃～90℃进行破壁10‑200min，获得破壁裂解液；B)离心、洗涤1‑10次；C)向破壁裂解液中按照质量比0.1％加入酶进行酶解，获得酶解液，所述的酶为碱性蛋白酶、溶菌酶和核酸降解酶，所述酶解的温度为40‑60℃，所述酶解的时间为10‑200min；D)对酶解液进行一次或多次的固液分离、一次或多次的加水洗涤以及一次或多次的固液分离，获得的沉淀经干燥后即为聚羟基脂肪酸酯。10.一种权利要求1‑9任一所述的方法获得的聚羟基脂肪酸酯在制备可降解的生物新材料中的应用，优选在开发医用器械、医用微球、手术缝合线、补片、一次性包装材料或纺织纤维中的应用。2CN113354802A说明书1/10页聚羟基脂肪酸酯的高纯度提取方法技术领域[0001]本发明涉及生物工程技术及生物化工技术领域，具体涉及一种聚羟基脂肪酸酯(PHA)的高纯度提取方法，包括高效破壁技术及高纯度酶解的提取工艺。背景技术[0002]聚羟基脂肪酸酯作为一种可降解的生物新材料，在医药、化工、农业、日用等领域具有广阔的应用前景。可用于开发医用器械、医用微球、手术缝合线、补片、一次性包装材料、纺织纤维等，由于其优异的生物可降解性与生物相容性，是公认最具潜力的绿色环保型高分子材料。[0003]尽管聚羟基脂肪酸酯在应用方面有诸多优势，且经过代谢工程改造，细菌可合成占细胞干重高达70％以上的PHA，但因为下游分离提取工艺复杂、对分子量破坏大，极大影响了材料的使用和推广。