重组人GLP-1-Fc融合蛋白的纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112661864A(43)申请公布日2021.04.16(21)申请号202011623423.0(22)申请日2020.12.30(71)申请人华润昂德生物药业有限公司地址252201山东省聊城市东阿县阿胶街78号申请人上海昂德生物科技有限公司(72)发明人黄菁刘海峰聂洪霞史传超朱汝解福生郝向慧(74)专利代理机构北京思元知识产权代理事务所(普通合伙)11598代理人余光军霍雪梅(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/18(2006.01)C07K1/22(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图2页(54)发明名称重组人GLP-1-Fc融合蛋白的纯化方法(57)摘要本发明公开了重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的纯化方法，包括，将含有重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的样品进行粗纯后采用制备型色谱进一步纯化；所述制备型色谱的纯化方法包括：(1)将初步提纯的产物进行阴离子交换层析；(2)采用梯度洗脱方式将吸附在柱子上的杂蛋白洗脱下来；(3)采用等度洗脱方式收集主峰即得目的产物。本发明纯化方法工艺简单可行，纯化后样品纯度高且得率高，可一步将粗样纯度由95.0％提高至99.6％以上，且可去除宿主蛋白，纯化后样品收率稳定，粗样样品的上样量大，极大的节省了纯化成本，工艺稳定可靠，具有较强的可放大性，适合作为工业化生产纯化重组人GLP‑1类似物Fc融合蛋白。CN112661864ACN112661864A权利要求书1/1页1.一种重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括，将含有重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的样品进行粗纯后采用制备型色谱进一步纯化。2.按照权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白样品的粗纯方法包括但不限于亲和层析、过滤离心法或硫酸铵沉淀法中的任何一种，优选为亲和层析法。3.按照权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述制备型色谱的纯化方法包括：(1)将初步提纯的产物进行阴离子交换层析；(2)采用梯度洗脱方式将吸附在柱子上的杂蛋白洗脱下来；(3)采用等度洗脱方式收集主峰即得目的产物重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白。4.按照权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析的填料选自DEAEFF系列、QSepharoseFF系列、SourceQ系列或PORPSHQ系列在的任何一种；优选PORPS50HQ填料；所述填料的平均粒度为10‑50μm，平均长度为15‑25cm，优选粒度为30‑50μm，优选长度为18‑22cm。5.按照权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的梯度洗脱方式中的流动相由流动相A和流动相B组成；所述流动相A选自硼砂缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液中的任何一种缓冲液；所述的流动相B选自硼砂氯化钠缓合液、Tris‑氯化钠缓合液或甘氨酸氯化钠缓合液中的任何一种缓冲液。6.按照权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述流动相A以及流动相B的pH值为6.5‑9.5，优选为pH8.5‑9.5；最优选为pH9.0。7.按照权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液的终浓度为50‑100mmol/L，优选为50mmol/L；氯化钠的终浓度为0.5‑1mol/L，优选为1mol/L。8.按照权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的梯度洗脱为B相在10‑20CV内由20％升至70％，优选为：B相在15CV内由40％升至60％，A相在15CV内由60％降至40％。9.按照权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述的等度洗脱方式为采用80％‑100％的B相进行等度洗脱；优选的，所述的等度洗脱方式为采用90％的B相进行等度洗脱洗脱梯度。10.按照权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，在采用制备型色谱进行纯化，检测柱温为18‑26℃，洗脱流速为1L/min，检测波长为280nm。2CN112661864A说明书1/7页重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的纯化方法技术领域[0001]本发明涉及融合蛋白的纯化，尤其涉及重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的纯化方法，属于重组人GLP‑1‑Fc融合蛋白的纯化领域。背景技术[0002]近年来，中国国内糖尿病患病率呈逐渐攀升趋势。据调查数据显示：2019年中国糖尿病患病人数约为1.16亿人，中国已成为全球糖尿病患病人数最多的国家；与此同时，糖尿病患者数量仍在持续快速增长。预测2040年中国糖尿病患病人群数量将达到1.51亿人。[0003]重组人胰高血糖素样肽‑1类似物(GLP‑I)，该多肽由31个氨基酸组成，能够刺激胰岛细胞产生胰岛素，从而达到控制血糖的目的。胰高血糖素样肽‑I(GLP‑I)可促进胰岛素释放，降低血