高效分离纯化重组人凝血因子VIII Fc融合蛋白的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113461827A(43)申请公布日2021.10.01(21)申请号202010242530.2(22)申请日2020.03.31(71)申请人安源医药科技（上海）有限公司地址201318上海市浦东新区紫萍路908弄3号(72)发明人贾世香徐时东俞灵菊周波吴洪袁永龙李强(51)Int.Cl.C07K19/00(2006.01)C07K1/22(2006.01)C07K1/20(2006.01)C07K1/18(2006.01)权利要求书3页说明书8页序列表14页附图2页(54)发明名称高效分离纯化重组人凝血因子VIIIFc融合蛋白的方法(57)摘要本发明公开了一种高效分离纯化重组人凝血VIII因子Fc融合蛋白的方法。所述方法包括亲和层析以及阴离子交换层析步骤；并且所述亲和层析捕获样品在pH4.0至8.0条件下，采用含5-20％多元醇类有机溶剂的盐离子缓冲液进行洗脱，蛋白样品经一步ProteinA亲和层析分离即可提纯至85％以上；所述纯化方法操作简便，每步层析之间自然衔接，回收率高、成本低且容易放大生产。CN113461827ACN113461827A权利要求书1/3页1.一种分离或纯化重组人凝血因子VIIIFc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)亲和层析：用蛋白A亲和介质捕获融合蛋白，再以洗脱缓冲液洗脱融合蛋白，收集分离产物；(2)阴离子交换层析：将上述步骤分离产物加载于季铵盐类强阴离子交换层析介质上，以洗脱缓冲液进行梯度洗脱，收集分离产物；其中，所述融合蛋白是由天然人FVIII或B结构域缺失的/截短的人FVIII及其变体通过肽接头与来源于人的任何抗体同种型的恒定区序列(Fc结构域)或其变体融合而成；所述Fc结构域选自例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区或其变体；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其变体；本发明的一优选实施例中，所述重组人凝血因子VIIIFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。其中，亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液包含浓度为0.2M至1.5M的一种或多于一种的盐、一种或多于一种的多元醇类有机溶剂和一种或多于一种的表面活性剂；和所述洗脱缓冲液还含有浓度为5mM至20mM的钙离子；和所述洗脱缓冲液还含有10mM至50mM的His-HCL缓冲剂；和所述洗脱缓冲液的pH为4.0至8.0，优选为5.0至6.0，更优选为5.0。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤在选自下列的亲和介质上进行：MabSelect、MabSelectSuRe、ProteinADiamond和MabSelectSuReLX；优选地使用MabSelectSuReLX。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析步骤在选自下列的强阴离子交换介质上进行：QHP、ToyopearlGigaCapQ-650、DEAEBeads6FF、GenerikMC-Q、FractogelEMDTMAE、QCeramicHyperDF，优选地使用QHP。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤，在融合蛋白洗脱前先使用不含或含有较低浓度的有机溶剂的去污缓冲液淋洗以去除部分污染物；所述去污缓冲液包含20mMHis-HCl、0.4-1.5MNaCl、10mMCaCl2、0.02-0.05％Tween-80、0-10％乙二醇，pH为5.0-7.0；优选为20mMHis-HCl、1.5MNaCl、10mMCaCl2、0.02％Tween-80、3-7％乙二醇，pH为5.0-7.0。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的盐包括氯化钠、氯化铵、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵等；优选为氯化物；最优选为盐是氯化钠。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的多元醇类有机溶剂包括乙二醇、1,2-丙二醇和丙三醇，优选为乙二醇；并且所述有机溶剂的比例为5-40％(w/w)，优选为5-20％。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的钙离子选自可溶性钙盐，包括氯化钙、乙酸钙、乳酸钙、苯甲酸钙；优选为氯化钙。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液所包含的表面活性剂为吐温-80(Tween-80)或曲拉通X-100(TritonX-100)，并且所述表面活性剂的浓度为0.01％至0.1％(v/v)，优选为0.02％至0.05％(v/v)。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析步骤中使用的洗脱缓冲液包含2