一种纯化猪轮状病毒的方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113073087A(43)申请公布日2021.07.06(21)申请号202110291568.3(22)申请日2021.03.18(71)申请人武汉科前生物股份有限公司地址430206湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路419号(72)发明人周明光张华伟周飞燕徐高原罗修鑫陈映瑾余蕾汤细彪(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人钱云(51)Int.Cl.C12N7/02(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种纯化猪轮状病毒的方法及其应用(57)摘要本发明涉及兽用疫苗技术领域，尤其涉及一种纯化猪轮状病毒的方法及其应用。所述方法包括：取片状载体培养的猪轮状病毒液作为待纯化病毒液；对所述待纯化病毒液进行膜包浓缩和离子交换层析：首先使用100～300KD膜包将病毒液浓缩，经过3次洗滤，将病毒液浓缩20倍后再利用离子交换层析技术将病毒捕获洗脱，达到精细分离纯化的目的。本发明通过特定的膜包浓缩技术结合离子交换层析，较大程度地增加了病毒的回收率，降低了杂蛋白的含量，提高了猪轮状病毒的浓度，可以应用至猪轮状病毒疫苗中。CN113073087ACN113073087A权利要求书1/1页1.一种纯化猪轮状病毒的方法，其特征在于，包括：取片状载体培养的猪轮状病毒液作为待纯化病毒液；对所述待纯化病毒液进行膜包浓缩和离子交换层析；所述膜包浓缩包括如下流程：使用100～300KD膜包将所述待纯化病毒液浓缩至起始体积的1/5～1/10，后补加缓冲液并浓缩至所述起始体积的1/10～1/20，再次补加缓冲液浓缩至所述起始体积的1/20～1/40。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述100～300KD膜包在使用前经过如下预处理流程：使用碱溶液对所述100～300KD膜包进行循环灭菌处理，再通过无菌注射水清洗所述100～300KD膜包至pH为6.8～7.2。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括，在所述膜包浓缩后，使用所述起始体积1/20～1/40的缓冲液冲洗膜包，收集洗膜液。4.根据权利要求1‑3任一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为0.01～0.02mol/L的PB溶液。5.根据权利要求1‑4任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析的介质为QFocurose6FF。6.根据权利要求1‑5任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析的洗脱液包括：含0.2～0.3mol/L的NaCl的PBS，所述PBS的浓度为0.01～0.02mol/L。7.根据权利要求1‑6任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析过程中，pH保持在8.0～8.1，和/或，病毒浓缩液上样的线性流速为50～60cm/h，和/或，压力小于2.5bar。8.权利要求1‑7任一项所述方法在制备用于免疫猪轮状病毒的药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。2CN113073087A说明书1/4页一种纯化猪轮状病毒的方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及一种纯化猪轮状病毒的方法及其应用。背景技术[0002]猪轮状病毒病是由轮状病毒感染引起的仔猪腹泻性疾病。主要症状为厌食、呕吐、下痢，中猪和大猪为隐性感染。病原体除猪轮状病毒外，人、鸡、牛、马等的幼龄动物分离的轮状病毒也可感染仔猪，引起不同程度的症状。轮状病毒对外界环境的抵抗力较强，在18～20摄氏度的粪便和乳汁中，能存活7～9个月。[0003]目前，猪轮状病毒广泛分布于各地养猪场，其高病死率给各地的养猪业带来巨大经济损失。但是针对猪的轮状病毒尚无特效药治疗，控制轮状病毒感染最有效的方法是接种疫苗，但是用于制备疫苗的原料病毒，通常在细胞中培养，收获的培养液除含有病毒外，还含有宿主蛋白核酸及培养过程中引入杂质，如果杂质含量过多，可能会对疫苗安全性及有效性产生不利影响。[0004]膜包浓缩技术是一种改革传统工艺实现高效纯化浓缩的技术。具体原理为料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。发明内容[0005]为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种纯化猪轮状病毒的方法及其应用。本发明通过特定的膜包浓缩技术结合离子交换层析，较大程度地增加了病毒的回收率，降低了杂蛋白的含量，提高了目标产物的浓度。[0006]第一方面，本发明提供一种纯化猪轮状病毒的方法，包括：[0007]取片状载体培养的猪轮状病毒液作为待纯化病毒液；[0008]对所述待纯化病毒液进行膜包浓缩和离子交换层析；[0009]所述膜包浓缩包括如下流程：[0010]使用100～300