一种猪细小病毒病毒样颗粒的纯化方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110283236A(43)申请公布日2019.09.27(21)申请号201910530218.0A61K39/125(2006.01)(22)申请日2019.06.19A61P31/20(2006.01)(71)申请人扬州优邦生物药品有限公司地址225000江苏省扬州市维扬经济开发区金槐路7号(72)发明人范娟丁国伟李群潘杰徐萍叶正琴李甜甜魏荣荣孙舒李琛(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211代理人林娟(51)Int.Cl.C07K14/015(2006.01)C07K1/18(2006.01)C12N15/866(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图1页(54)发明名称一种猪细小病毒病毒样颗粒的纯化方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种猪细小病毒病毒样颗粒的纯化方法及其应用，属于生物制品分离纯化技术领域。该方法包括如下步骤：将表达的猪细小病毒病毒样颗粒的培养物进行澄清，收集上清液并用二乙烯亚胺灭活，以得到半成品；调节半成品的pH值酸性；将调节pH值后的半成品加入到用第一缓冲液平衡过的弱阴离子交换柱中，并用第二缓冲液洗脱弱阴离子交换柱，收集各个出峰组分；用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的各个峰的活性蛋白组分。根据本发明的纯化方法得到的猪细小病毒病毒样颗粒纯度高达90％，回收率高达99％，且该纯化方法利于生产操作，为猪细小病毒杆状病毒载体灭活疫苗的制备提供了更加安全可靠的途径。CN110283236ACN110283236A权利要求书1/1页1.一种猪细小病毒病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将表达猪细小病毒病毒样颗粒的培养物进行澄清，收集上清液并进行灭活，以得到半成品；(2)调节半成品的pH值至5.5～6.0；(3)将调节pH值后的半成品加入到弱阴离子交换柱中，洗脱弱阴离子交换柱，收集各个出峰组分。2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述的弱阴离子交换柱为DEAE-阴离子交换柱。3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中用的病毒灭活剂为二乙烯亚胺。4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中表达猪细小病毒病毒样颗粒的培养物的获取包括如下步骤：用嵌合有编码猪细小病毒VP2蛋白基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养昆虫细胞，以得到表达猪细小病毒病毒样颗粒的培养物。5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，培养昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为25℃～30℃，转速为130rpm～150rpm，培养时间为96h～144h。6.如权利要求4或5所述的纯化方法，其特征在于，培养昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为27℃，转速为140rpm，培养时间为96h～120h。7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用第一缓冲液平衡弱阴离子交换柱，第一缓冲液包括18～20mM的乙酸钠和0.1～0.3M的NaCl，第一冲液的pH为5.0～5.5。8.如权利要求1或7所述的纯化方法，其特征在于，使用第二缓冲液洗脱弱阴离子交换柱，第二缓冲液包括18～20mM乙酸钠和1.0～1.2MNaCl，第二缓冲液的pH为5.0～5.5。9.如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，第二缓冲液的体积为弱阴离子交换柱体积的3～5倍。10.通过权利要求1-9任一所述的纯化方法得到的猪细小病毒病毒样颗粒的疫苗。2CN110283236A说明书1/8页一种猪细小病毒病毒样颗粒的纯化方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种猪细小病毒病毒样颗粒的纯化方法及其应用，属于生物制品分离纯化技术领域。背景技术[0002]猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，是一种自主复制型病毒，临床常以妊娠母猪流产、死胎、畸形胎、胎儿木乃伊化及弱仔等一系列症状为特征。猪细小病毒病常与其他导致母猪繁殖障碍的病原混合感染而致病，给养猪业带来了严重的损失。[0003]迄今为止，国内普遍应用的疫苗主要为全病毒灭活疫苗和杆状病毒表达的重组亚单位疫苗，相对于全病毒灭活疫苗而言，亚单位疫苗具有抗原表达量高的优点，但杆状病毒表达的重组亚单位疫苗在临床应用中存在一些过敏反应(如呕吐、震颤等)，这些副反应的产生主要是由于亚单位疫苗未经纯化而引起的。对于重组病毒样颗粒抗原的纯化，通常包括细胞裂解、粗提、浓缩和精制等步骤。但从产业化生产的角度来看，在保证VLP的纯度和质量的前提下，亟需一种简单、省时、经济、高产和可控的重组病毒样颗粒抗原的纯化方法。特别对于兽用疫苗而言，其产品附加值本身较低，如果采用步骤繁琐的纯化工艺，其生产成本必然会大大增加。[0004]目前，还未有